Un saggio del biofilm su piastra a pioli per lo screening di agenti antibatterici

Prelevare una piastra per microtitolazione con coperchio dotato di supporti cilindrici, o pioli, rivestiti di biofilm batterici.

Posizionare il coperchio del piolo rivestito di biofilm sui pozzetti della piastra per microtitolazione con tampone per eliminare i batteri poco attaccati o planctonici, concentrandosi sulle misurazioni attaccate al biofilm.

Trasferire il coperchio del piolo rivestito di biofilm risciacquato su una piastra di sfida con concentrazioni crescenti di agenti antibatterici di prova. Incubare senza agitare.

A seconda della concentrazione dell'agente e del potenziale antibatterico, interrompe l'attività metabolica batterica e l'integrità del biofilm.

Dopo l'incubazione, posizionare il coperchio del piolo sui pozzetti della piastra contenenti tampone per rimuovere i batteri planctonici.

Trasferirlo in pozzetti per piastre per microtitolazione con un terreno di recupero del biofilm contenente resazurina, un colorante permeabile alle cellule, debolmente fluorescente. Incubare.

Nei batteri metabolicamente attivi, gli enzimi deidrogenasi riducono la reazurina di colore blu in resorufina fluorescente di colore rosa.

La mancanza di conversione della resazurina indica l'eradicazione del biofilm, mentre la conversione in resorufina suggerisce la presenza di cellule vitali.

La concentrazione più bassa dell'agente antibatterico del test che non produce conversione della resazurina denota la concentrazione minima di eradicazione del biofilm.

Prendere una piastra fresca da 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di CRPMI bilanciato a temperatura ambiente a ciascun pozzetto delle file da B a H. Diluire fino a quattro composti di prova separatamente in 1,0 millilitri di CRPMI a 2 volte la concentrazione finale desiderata. Aggiungere 200 microlitri di composto uno nei pozzetti da A1 ad A3, 200 microlitri di composto due nei pozzetti da A4 ad A6, 200 microlitri di composto tre nei pozzetti da A7 ad A9 e 200 microlitri di composto quattro nei pozzetti da A10 ad A12.

Diluire in serie i composti in esame utilizzando una pipetta multicanale. Iniziare trasferendo 100 microlitri dalla fila A alla fila B e mescolare. In questo modo, continua a trasferire 100 microlitri da bene a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e fermarsi nella fila F. Dopo la miscelazione, espellere 100 microlitri dalla fila F in un contenitore per rifiuti. Non trasferire alcun liquido nelle file G e H. Infine, aggiungere 100 microlitri di CRPMI a ciascun pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale, per portare il volume finale a 200 microlitri.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato a una piastra sterile a 96 pozzetti fresca con pozzetti di dimensioni identiche a quelle della piastra di inizio del biofilm. Quindi, rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola di paraffina dalla piastra di inizio del biofilm incubata. Sollevare il coperchio verso l'alto, evitando il contatto tra i pioli e il fondo della piastra in quanto ciò potrebbe danneggiare il biofilm. Conservate la parte inferiore per la successiva analisi OD₆₀₀.

Sciacquare le cellule planctoniche posizionando il coperchio del piolo sulla piastra contenente PBS. Immergi i pioli per 5 secondi, sollevali dal PBS e immergili ancora una volta, facendo attenzione a non sbattere i pioli contro i lati del pozzo. Posizionare il coperchio del piolo risciacquato nella piastra di sfida. Evitare il contatto non necessario tra i pioli e la piastra inferiore, in quanto ciò danneggerebbe il biofilm portando a risultati incoerenti.

Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e metterla in un sacchetto di plastica sigillabile come prima. Incubare la piastra senza agitare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Prelevare il fondo della piastra di inizio del biofilm e risospendere i batteri in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Misurare l'OD₆₀₀ con un lettore di micropiastre adatto per confermare la crescita che si verifica in tutti i pozzetti, ma i controlli di sterilità nella riga H.

Utilizzare un lettore di piastre dotato di una camera di incubazione e in grado di effettuare letture di fluorescenza cinetica per rilevare la conversione della resazurina. Imposta una misurazione della fluorescenza cinetica 24 ore utilizzando un'eccitazione di 530 nanometri e un'emissione di 590 nanometri. Impostare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius e far leggere la piastra ogni 20 minuti.

Impostare il lettore di piastre in modo che misuri dalla parte inferiore della piastra, secondo le istruzioni del produttore. Prepararsi a lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di PBS a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti con una pipetta multicanale. Quindi, preparare il terreno di recupero del biofilm aggiungendo 400 microlitri di soluzione madre di resazurina da 0,8 milligrammi per millilitro a 20 millilitri di terreno CRPMI, fino a una concentrazione finale di 16 microgrammi per millilitro di resazurina.

Quindi, aggiungere 150 microlitri di terreno di recupero del biofilm con una pipetta multicanale, a ciascun pozzetto di una piastra fresca a 96 pozzetti. Trasferire la piastra di verifica dall'incubatrice in una cabina di biosicurezza e rimuovere con cautela il sacchetto di plastica e la pellicola sigillante. Rimuovere il coperchio del piolo dalla piastra di provocazione e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come prima, mantenendo il fondo della piastra di provocazione per la successiva analisi OD₆₀₀.

Dopo il risciacquo, posizionare il coperchio del piolo sul fondo della piastra contenente il mezzo di recupero del biofilm. Avvolgere il lato della piastra con pellicola di paraffina, facendo attenzione a non ostruire il fondo dei pozzetti perimetrali. Subito dopo aver avvolto la piastra, posizionarla sul lettore di piastre e avviare una lettura cinetica nell'arco di 24 ore avviando il protocollo cinetico di resazurina precedentemente realizzato.