Utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per valutare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie

Inizia con un vetrino coprioggetti funzionalizzato con nanoparticelle d'oro ancorate al polietilenglicole.

Aggiungere sonde di tensione a forcina di DNA contenenti una forcina di DNA ibridata con due oligonucleotidi in bracci opposti.

Il filamento del legante include un fluoroforo e una biotina, mentre il filamento di ancoraggio contiene un quencher e un gruppo tiolico. In questa configurazione, il quencher sopprime la fluorescenza.

Le sonde di DNA si legano alle nanoparticelle d'oro, ancorandosi al vetrino coprioggetti.

Introdurre la streptavidina, interagendo con le molecole di biotina dei filamenti del ligando.

Aggiungere ligandi biotinilati che si legano alle molecole di streptavidina pre-legate.

Sovrapporre il vetrino coprioggetti con cellule T CD8-positive; i loro recettori interagiscono con i ligandi immobilizzati, formando un sito di interazione recettore-ligando.

Questa interazione genera una forza che dispiega la struttura della forcina del DNA, separando il fluoroforo dal quencher e promuovendo l'emissione di fluorescenza.

Introdurre filamenti di bloccaggio non fluorescenti che interagiscono con i segmenti aperti delle sonde per preservare il segnale di fluorescenza.

Quantificare la fluorescenza per valutare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie.

Per iniziare, posizionare i vetrini coprioggetti da 25 millimetri su una griglia di politetrafluoroetilene in un becher da 50 millilitri e sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte immergendoli in acqua. Mescolare volumi uguali di etanolo e acqua e aggiungere 40 millilitri di questa soluzione al becher contenente il rack e i vetrini. Quindi, sigillare il becher con del nastro parafilm.

Pulire i vetrini coprioggetti facendo sonicare il becher per 15 minuti in un pulitore a ultrasuoni ed espellere il liquido dopo la sonicazione. Quindi, sciacquare il becher contenente la rastrelliera e i vetrini coprioggetti con acqua, almeno sei volte per rimuovere eventuali residui di solvente organico. Per preparare una soluzione di piranha fresca, aggiungi 30 millilitri di acido solforico in un becher da 50 millilitri e aggiungi lentamente 10 millilitri di perossido di idrogeno. Mescola delicatamente la soluzione di piranha usando l'estremità di una pipetta di vetro.

Per iniziare l'incisione, trasferire il rack che contiene i vetrini coprioggetti nel becher contenente la soluzione di piranha e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per pulire e idrossilare i vetrini. Quindi, trasferire la griglia utilizzando una pinzetta in acciaio o politetrafluoroetilene in un becher pulito da 50 millilitri e risciacquare con acqua sei volte. Per rimuovere completamente l'acqua, immergere la rastrelliera contenente i vetrini coprioggetti in un becher da 50 millilitri con 40 millilitri di etanolo, quindi scartare l'etanolo.

Successivamente, immergere il rack in 40 millilitri di etanolo contenente il 3% di aminopropil trietossisilano per 1 ora a temperatura ambiente per avviare la reazione con il gruppo ossidrile sui vetrini. Sciacquare sei volte la superficie dei vetrini coprioggetti immergendoli in 40 millilitri di etanolo, e asciugarli in forno a 80 gradi Celsius per 20 minuti.

Coprire il fondo interno della capsula di Petri con del nastro adesivo parafilm per evitare che i vetrini scivolino all'interno della capsula di Petri. Quindi, posizionare i vetrini coprioggetti ricoperti di ammina con il lato da funzionalizzare con le sonde di tensione del DNA rivolte verso l'alto. Coprire i vetrini coprioggetti a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro.

Per modificare i gruppi amminici sui vetrini, aggiungere acido lipoico-PEG-NHS e mPEG-NHS e incubare la capsula di Petri a temperatura ambiente per 1 ora. Al termine dell'incubazione, sciacquare la superficie tre volte con acqua. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di bicarbonato di sodio molare 0,1 contenente 1 milligrammo per millilitro di acetato di Sulfo-NHS a una serie di vetrini coprioggetti a sandwich e incubare per 30 minuti affinché avvenga la passivazione.

Aggiungere 0,5 millilitri di nanoparticelle d'oro a ciascun vetrino coprioggetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua tre volte. Dopo aver aggiunto il black hole quencher 2 filamenti alla sonda di tensione del DNA ricotto con un rapporto di 10 a 1, aggiungere 100 microlitri di miscela per due vetrini coprioggetti per fare il sandwich.

Posizionare con cautela una pallina di tessuto da laboratorio bagnata nella capsula di Petri, lontano dai vetrini coprioggetti, e sigillare la capsula con nastro parafilm per evitare che la soluzione si asciughi. Dopodiché, copri il piatto con un foglio e incubalo a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, assemblare la camera di imaging facendo attenzione a prevenire crepe superficiali durante il serraggio della camera. Quindi, aggiungere da 0,5 a 1 millilitro della soluzione salina bilanciata di Hank alla camera di imaging.

Utilizzare il canale Cy3B con un obiettivo 100x per catturare i segnali fluorescenti delle cellule piatte sulle sonde di tensione a forcina del DNA quando iniziano a diffondersi. Dopo aver preparato 100 filamenti di bloccaggio micromolari non fluorescenti, al momento desiderato, aggiungerlo alle cellule a una concentrazione finale di 1 micromolare nella camera di imaging per memorizzare il segnale di tensione e mescolarlo con le cellule mediante pipettaggio.

Dopo circa 10 minuti di blocco, acquisire filmati time-lapse o immagini del punto finale in epifluorescenza sia per la mappatura qualitativa della tensione che per l'analisi quantitativa.