Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Prendi un piatto con fondo di vetro rivestito di polimero contenente globuli rossi opsonizzati IgG o RBC aderiti alla sua superficie.

Posizionare la capsula su un tavolino per microscopio a fluorescenza a riflessione totale interna, mantenendolo a temperatura fisiologica.

Aggiungere macrofagi contenenti peptidi citoplasmatici marcati in fluorescenza che si legano all'actina polimerizzata, facilitando la visualizzazione del citoscheletro.

Durante l'imaging, dirigere un raggio laser con un angolo superiore all'angolo critico, provocando la riflessione interna e la generazione di onde evanescenti nel punto di contatto.

Le onde evanescenti illuminano selettivamente i fluorofori all'interfaccia vetro-campione, consentendo la visualizzazione in tempo reale della fagocitosi.

I recettori Fc dei macrofagi si legano ai globuli rossi opsonizzati IgG, causando l'aggregazione dei recettori attorno all'area di contatto.

Il clustering innesca le vie di segnalazione intracellulare e l'attivazione della GTPasi, guidando la polimerizzazione dell'actina e il reclutamento della dinamina, formando pseudopodi.

Gli pseudopodi si estendono attorno ai globuli rossi, formando una coppa fagocitica.

Alla fine, le punte degli pseudopodi si fondono. La dinamina accumulata media la separazione dei fagosomi dalla membrana cellulare, internalizzando i globuli rossi opsonizzati.

Per la fissazione non covalente degli SRBC, versare 2 millilitri di cellule opsonizzate con IgG in ciascuna delle piastre rivestite di polilisina e centrifugare i campioni in una centrifuga a rotore oscillante. Scartare i surnatanti e lavare le particelle una volta con 2 millilitri di PBS più il 10% di BSA.

Quindi, incubare le particelle con 2 millilitri di PBS fresco più il 10% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da tre lavaggi con 2 millilitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2 millilitri di terreno di microscopia privo di siero a 37 gradi Celsius.

Posizionare un piatto con codifica SRBC sul tavolino del microscopio. Quindi, raschiare le cellule trasfettate di interesse dal fondo del piatto di coltura e pipettare le cellule alcune volte per ottenere una sospensione a cellula singola. Aggiungere le cellule trasfettate al piatto rivestito con SRBC.

Avvia il software di acquisizione in tempo reale. Trova una cellula che esprime le proteine marcate in fluorescenza e regola la posizione del piatto in modo che una cellula di interesse si trovi al centro del campo. Acquisisci 500 immagini con angoli diversi, da 0 a 5 gradi con incrementi di 0,01 gradi a una lunghezza d'onda di eccitazione.

Per determinare l'angolo critico in cui la luce incidente deve essere completamente riflessa all'interfaccia vetro-mezzo e generare un'onda evanescente, aprire la sequenza di immagini nel software di imaging appropriato. Selezionare una regione di interesse nella cella con fluorescenza uniforme.

Quindi, nella scheda Immagine, selezionare Pile e tracciare il profilo dell'asse Z. Tracciare il profilo dell'asse Z Intensità media di fluorescenza misurata nella regione di interesse con la funzione degli angoli sull'asse X. Qualsiasi valore dell'angolo sull'asse x superiore all'angolo critico può quindi essere utilizzato durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF.