Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso d'uovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni

In questo video verrà mostrata l'isolazione di anticorpi IgY da galline, che possono essere immunizzate con la gomma genica, con un plasmide oppure, in modo più tradizionale, mediante iniezione intramuscolare. In primo luogo, viene isolato il tuorlo d'uovo. Successivamente, i lipidi vengono precipitati, seguiti dalla precipitazione di una frazione proteica contenente gli anticorpi, che vengono poi isolati attraverso un ulteriore passaggio di precipitazione.

Infine, gli anticorpi vengono dializzati contro PBS. Sì. Ciao. Mi chiamo Ard. Questo è il mio collega, Adema, e lavoriamo qui nel molto antico e famoso Istituto di Farmacologia, che appartiene alla Medicina Universitaria SHA di Berlino.

E di seguito, vorremmo mostrarvi l'estrazione di IGY da uovo di gallina, yogurt, e da un prodotto che riteniamo un metodo molto, molto semplice e anche estremamente economico. Nel complesso, questi metodi appartengono alla cosiddetta tecnologia IGY. Il primo passo nella preparazione dell'IGY è l'isolamento del tuorlo d'uovo.

Per questa procedura, abbiamo bisogno di portaprovette, carta da filtro con tappi blu, punte per pipetta, tampone, un becher di vetro, un cucchiaino per separare il tuorlo dall'albume e, naturalmente, le uova. L'uovo viene aperto sopra il cucchiaino per tuorlo per far defluire l'albume. Successivamente, il cucchiaino contenente il tuorlo viene agitato delicatamente per rimuovere la maggior parte dell'albume.

Il tuorlo viene quindi trasferito sulla carta da filtro per rimuovere le proteine dell'albume nel modo più completo possibile. La membrana del tuorlo è molto stabile nelle uova, purché non abbiano più di un mese; dopo tre mesi di conservazione, la stabilità diminuisce. La membrana del tuorlo può rompersi a causa del processo di invecchiamento durante il rotolamento sulla carta da filtro.

In seguito, la membrana del tuorlo viene aperta con la punta di una pipetta e trasferita in un tubo. Infine, si osserva che il tuorlo ha un volume di circa 15 millilitri. Questo volume è normale per una gallina adulta in fase di deposizione e varia solo minimamente.

Il volume del tuorlo viene registrato. Il polietilene glicole al 3,5% viene utilizzato come precipitante in tampone PBS per separare le proteine del tuorlo, inclusa l'IGY, dai lipidi presenti nel tuorlo d'uovo; 1,58 grammi di polietilene glicole, corrispondenti al 3,5% del volume finale di tuorlo e tampone, vengono pesati su una bilancia. I 15 millilitri di tuorlo vengono mescolati con il doppio del volume di tampone PBS, quindi vengono aggiunti 30 millilitri di PBS per un volume finale di 45 millilitri. Il polietilene glicole viene quindi aggiunto alla miscela.

Il tubo viene chiuso con il tappo e quindi vortexato accuratamente per 20-30 secondi. Invertire periodicamente il tubo durante la procedura di vortexaggio.

Dopo aver agitato con il vortex, il tuorlo dovrebbe essere completamente in sospensione. I tubi vengono ora posizionati su un agitatore rotante per 10 minuti. Il risultato è una miscela omogenea con un colore modificato, da giallo a giallo chiaro.

Ora la miscela viene centrifugata per 20 minuti. La centrifugazione separa un sopranatante chiaro contenente IgY e altre proteine da un precipitato giallo, costituito principalmente da lipidi. Nel passaggio successivo, il sopranatante S viene versato attraverso un filtro piegato e trasferito in un nuovo tubo.

Il nuovo volume viene registrato e il precipitato viene scartato. A questo punto, nuovamente, il polietilene glicole viene aggiunto al soprannatante a una concentrazione finale del 12%, ovvero il 3,5% nella prima precipitazione più l'8,5% del volume risultante di SNAT, per un totale del 12%. Successivamente, la soluzione viene mescolata, incubata su un agitatore rotante come in precedenza e centrifugata per 20 minuti. A questo punto, il polietilene glicole precipita l'IgY e altre proteine.

Dopo questo passaggio di centrifugazione, il pellet verrà utilizzato per la preparazione alla dissoluzione. I bastoncini di vetro del pellet vengono disinfettati con etanolo al 70%; mentre i bastoncini si asciugano, il soprannatante S viene scartato. Successivamente, il tubo viene capovolto per far defluire l'ultima parte del soprannatante.

Si aggiunge quindi un millilitro di PBS al pellet. Il pellet viene disciolto utilizzando l'asticella di vetro mentre si esegue una vortexazione completa. Ora si osserva una soluzione leggermente giallastra.

Ora, viene aggiunto PBS fino a un volume finale di 10 millilitri, seguito da una terza precipitazione con polietilene glicole alla concentrazione del 12%, come in precedenza, a differenza della seconda centrifugazione. Questa volta, si ottiene un precipitato bianco dopo la centrifugazione per 20 minuti. Il pellet viene solubilizzato nello stesso modo di prima, ma in due passaggi.

Nel primo passaggio, viene disciolto in 0,8 millilitri di PBS e trasferito in una capsula di microdialisi. Successivamente, il tubo viene risciacquato con ulteriori 0,4 millilitri di PBS, che vengono anch'essi trasferiti nella capsula. Nel passaggio successivo, un sacchetto da dialisi viene tagliato con forbici disinfettate e risciacquato con acqua distillata.

Il sacchetto da dialisi viene quindi posizionato sulla parte inferiore della capsula e chiuso saldamente con la parte superiore. Infine, le capsule vengono trasferite in un becher di vetro posto su un agitatore magnetico. La soluzione di IGY viene dializzata tutta la notte contro soluzione salina allo 0,1%.

Il giorno successivo, la soluzione di IGY viene dializzata per tre ore contro PBS. Al termine della dialisi, la membrana di dialisi viene perforata con la punta di una pipetta e la soluzione di IGY viene rimossa e trasferita in un piccolo tubo. Il volume finale viene registrato.

Il prodotto finale è una soluzione limpida, che può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per diversi anni. Secondo la nostra esperienza, non conservare il preparato di IGY a meno 70 gradi Celsius poiché abbiamo osservato una significativa perdita di attività a questa temperatura. Bene, speriamo di essere riusciti a convincervi che l'estrazione di IDY da a è una procedura davvero semplice ed efficace se si segue il nostro protocollo.

L'attrezzatura necessaria è minima, e riteniamo che esista un rapporto equilibrato tra sforzo e beneficio. Spero che questa pubblicazione video vi incoraggi a sfruttare al meglio il nostro protocollo e anche la tecnologia, come farò io. Grazie.