Name: Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso duovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Impara l'estrazione di anticorpi IgY dal tuorlo d'uovo mediante precipitazione con polietilenglicole. Questo metodo semplice e conveniente fornisce un alto rendimento di anticorpi attivi per la ricerca immunologica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della Ricerca (Progetto BiGRUDI [Bi ologische efahrenlagen G: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ho dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Ringraziamo B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) per un&#39;eccellente assistenza tecnica.

1. Protocollo - IgY-estrazione con PEG-precipitazione Fig. 1 riporta lo schema del IgY estrazione procedura (cfr. tabella 2). Il protocollo è stato descritto nel Polson et al. 1980. Tutti i passaggi devono essere effettuate utilizzando guanti di lattice. <ol><li> Il guscio è incrinato con cura e il tuorlo è trasferito in un "cucchiaio tuorlo" al fine di rimuovere come un uovo più bianco possibile. </li><li> Il tuorlo è trasferito in una carta da filtro e laminati per rimuovere restante albume, tuorlo poi la pelle è tagliata con un bisturi o uno strumento simile (puntale). Il tuorlo viene versato in un tubo da 50 ml e il volume dell'uovo è registrata (V1). </li><li> Il doppio del volume tuorlo d'uovo di PBS è mescolato con l'(ΣV1 + V2) tuorlo, dopo PEG 6000 del 3,5% (in grammi, polverizzati) del volume totale è aggiunto e in agitazione, seguiti da 10 minuti che rotola su un mixer di rotolamento. Questo passo della procedura di estrazione separa la sospensione in due fasi. Una fase consiste nel "solidi tuorlo e sostanze grasse" (citazione originale di Polson et al. 1980) e una fase acquosa contenente proteine ​​IgY e altri. </li><li> I tubi vengono centrifugati a 4 ° C per 20 min (10.000 rpm in base a 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, rotore ad angolo fisso). Il supernatante (V3) è versato attraverso un filtro a pieghe e trasferito in una nuova provetta. </li><li> PEG 6000 8,5% in grammi (calcolato in base al nuovo volume), vengono aggiunti al tubo, in agitazione e arrotolato su un mixer a rotazione come nel punto 3. </li><li> Ripetere il punto 4 con la differenza che il supernatante viene scartato. </li><li> Il pellet viene accuratamente sciolto in 1 ml di PBS per mezzo di un bastoncino di vetro e il vortex. PBS viene aggiunto a un volume finale di 10 ml (V4). La soluzione è mescolata con 6000 PEG 12% (w / v, 1,2 grammi) e trattati come al punto 3 (vortice, mixer rotolamento). </li><li> Ripetere il passaggio 6 e sciogliere il precipitato con cura in 800 microlitri di PBS (bastone di vetro e vortex). Attendere che le bolle d'aria a scomparire e poi il trasferimento (pipetta) l'estratto di una capsula dialisi. Lavare il tubo con 400 microlitri di PBS e aggiungere il volume al dispositivo di dialisi (V5). (Per la preparazione di dispositivi di dialisi e le membrane vedi appendice). </li><li> L'estratto è dializzato durante la notte in soluzione salina 0,1% (1.600 ml) e delicatamente mescolato per mezzo di un agitatore magnetico. La mattina seguente, la salina, è sostituito dal PBS e dializzati per altre tre ore. </li><li> Successivamente, la IgY estratto è tirato dalla capsula dialisi da una pipetta e trasferito in provette 2 ml. Il volume finale è di circa 2 ml (V6). </li><li> Il contenuto di proteine ​​(mg / mL) dei campioni è misurata fotometricamente a 280 nm (1:50 diluito con PBS) e calcolato in base alla legge di Lambert-Beer con un coefficiente di estinzione di 1,33 per IgY (vedi fig. 2), Fig. . 4 mostra la qualità della preparazione (la purezza e il recupero sono circa l'80%). </li><li> Si consiglia di conservare i campioni in aliquote a -20 ° C (non congelare i campioni a -70 ° C). </li><li> La qualità della preparazione finale è analizzato da semplici SDS-PAGE, come descritto nel protocollo JOVE <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Appendice-prima di usare il sacco a dialisi deve essere preparato nel modo seguente secondo le raccomandazioni del costruttore: <ol><li> 20 sacchi dialisi vengono tagliate a pezzi di 30 cm e dato in un bicchiere di vetro 2000 ml. </li><li> 1.750 ml di 5 mm con EDTA soluzione vengono aggiunti. </li><li> Un imbuto di vetro è posto sopra i sacchetti per garantire che le borse sono coperti dalla soluzione di EDTA. La soluzione è riscaldata e bollito per 5 min (piastra calda). La soluzione è decantato e le borse sono lavati tre volte con acqua distillata. </li><li> Ancora una volta 1.750 ml con EDTA soluzione sono aggiunti, bolliti per 5 minuti e lavati tre volte con acqua distillata come sopra. </li><li> Infine le borse di dialisi vengono bolliti per 10 minuti in acqua distillata e conservato a 4 ° C. Estrarre le borse dialisi per mezzo di pinzette sterilizzate. </li></ol> 3. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schema di IgY-estrazione mediante precipitazione polietilene glicole secondo la descrizione originale di Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Per visualizzare l'immagine ingrandita clicca qui.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sviluppo del totale-IgY nel tuorlo d'uovo di gallina immunizzati in dipendenza di età. Dato è la media settimanale del totale IgY / uovo e SD (n = 4 galline ovaiole). Da [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Layicapacità di controllo ng di quattro galline immunizzati con antigeni diversi. Le frecce indicano la data di vaccinazione (da [Pauly et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Per visualizzare un'immagine più grande clicca qui.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Poliacrilammide-elettroforesi in gel di preparati IgY individuali da uova diverse in condizioni riducenti Corsia 1 - marcatore di peso molecolare, Lane 2 - IgY standard, Lane 3-5 - campioni IgY diverse preparato come descritto nel protocollo. Questi sono gli ultimi preparativi in ​​base al punto 10 del protocollo. HC - catene pesanti, LC - chaines luce,? - Impurità minore, corrispondente al peso molecolare di circa 35 kDa (probabilmente il frammento C-terminale del precursore vitellogenina II, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Pollo 21 (Antigen A) </td><td> Pollo 22 (Antigen A) </td><td> Pollo 19 (B Antigen) </td><td> Pollo 23 (C Antigen) </td></tr><tr><td> Numero di uova (IgY totale) 1, 2 anni di periodo </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Numero di uova (IgY totale), primo anno </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Numero di uova (IgY totale), secondo anno </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Di max. numero possibile di uova (primo anno) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Di max. uovo numero possibile (secondo anno) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> numero di uova trattate </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 La quantità di IgY totale viene calcolato moltiplicando il numero delle uova per un valore medio di 60 mg di proteina per uovo secondo i dati della Figura 2. 2 La max. numero possibile di uova all'anno, si trova a 325 in base ad un informazione del selezionatore. Tabella 1. Statistiche Due anni di capacità di deposizione delle uova di polli immunizzati con antigeni diversi. Posa capacità in percentuale del massimo di quattro galline dopo l'immunizzazione con antigeni diversi, come pure la IgY-risultato nel corso di due anni (vedi anche fig. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> Uovo nr. </td><td> Nr. gallina. Posa Data </td><td> V1 [ml] tuorlo </td><td> V2 [ml] di PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol. [ml] dopo </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Pallina </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Pallina </td><td> Vol. [ml] </td><td> Proteine ​​totali mg / ml </td><td> Corretto proteine ​​totali mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. e filtrazione V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> disciolti in ml V4 PBS </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Sciolto in ml di PBS V5 </td><td> Dopo la dialisi contro PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Protocollo esemplare di PEG precipitazioni

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla pelliccia Landesamt Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03).

La scelta di un metodo adeguato di purificazione IgY è influenzata dalla scala di purificazione (laboratorio o industriale), redditività, tecnologia (attrezzature di laboratorio), e l&#39;impatto sull&#39;ambiente (gestione dei rifiuti). Vari metodi di estrazione IgY sono state esaminate in dettaglio da De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, per una rassegna vedi anche Schade et al. 2005). In generale, questi metodi possono essere divisi in tre gruppi principali: <ol><li> Metodi di precipitazione: coinvolgere solfato di ammonio o di sodio, polietilenglicole (PEG), acido caprilico e caragenean. </li><li> Metodi cromatografici: cromatografia di affinità, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di interazione idrofobica, cromatografia di interazione thiophylic, gel-filtrazione e cromatografia. </li><li> Ultrafiltrazione. </li></ol> La purezza di una preparazione IgY può essere aumentata con una combinazione di metodi, ad esempio, PEG precipitazione può essere combinato con cromatografia di affinità. In alcuni casi, a seconda dell&#39;applicazione finale, un estratto di IgY acqua è sufficiente per ottenere buoni risultati (Akita &amp; Nakai 1993). Secondo la nostra esperienza, il IgY-campione si ottiene con PEG-precipitazione ha lavorato molto bene in un sacco di diversi saggi immunologici. Uniformando i PEG-precipitazione metodo di un assistente tecnico è in grado di elaborare circa 84 uova a settimana, il che corrisponde ad un importo di IgY totale tra 4 e 7 grammi a settimana. Un semplice calcolo: una gallina ovaiola è immunizzati con un antigene. Dopo un paio di vaccinazioni aumentare la gallina produce anticorpi specifici (Ab) con un titolo di 1:50.000 durante un periodo di 30 giorni. 30 uova x 2 ml IgY estratto (vedi protocollo e fig. 3) corrisponde a 60 ml IgY totale, che a sua volta corrisponde ad un Ab-diluizione di 3.000 litri (la capacità di un secchio è di 10 l), questo significa che con 3.000 l della soluzione di Ab 300 secchi possono essere riempiti. Così, in vista di tale enorme quantità di Ab-non è un problema di memorizzare un Ab-piscina di qualità costante e specificità. Questa tecnica riduce il carico / lotto altrimenti variabilità osservata in polispecifico Ab. Nonostante l&#39;aspetto della quantità, IgY Ab hanno ulteriori vantaggi rispetto ai mammiferi IgG: Nessuna attivazione del sistema del complemento mammiferi, nessun cross-reattività con HAMA (umano anticorpo di topo anti), fattori reumatoidi o umano antigeni del gruppo sanguigno (mancanza di heteroagglutinins). Un vantaggio eccezionale di IgY-Ab è la cosiddetta distanza filogenetica. Distanza filogenetica è la ragione per le differenze spesso descritto tra le specificità Ab dei mammiferi e dei polli, anche se in modo identico immunizzati. Oltre alle differenze tra i mammiferi e il sistema immunitario aviaria se stessi, le differenze di sviluppo filogenetico in queste due classi di animali contribuisce alla specificità diverse Ab. Diversi autori hanno riportato che i polli spesso producono Abs contro filogeneticamente proteine ​​altamente conservate mammiferi o peptidi in modo più efficiente di quanto non facciano i conigli (per una rassegna vedi Schade et a. 2005). Di conseguenza, un antigene conservato può rimanere &quot;mascherato&quot; per il sistema immunitario coniglio, e quindi causare solo un debole o una risposta &quot;silenziosa&quot;. Inoltre, se polli e conigli sono immunizzati con lo stesso antigene mammiferi, molto spesso i polli rispondere con un Ab-specificità che raramente possono essere raggiunti in conigli. Anche l&#39;aspetto del benessere degli animali è importante in quanto la Ab non invasiva estratto da tuorlo d&#39;uovo. In combinazione con Gene-Gun (plasmide) l&#39;immunizzazione IgY-produzione è completamente non invasivo (Witkowski et al. 2009). In conclusione, la produzione di Ab in galline e il IgY-estrazione con PEG-precipitazione è molto conveniente e risulta in Ab altamente specifico con titoli stabile fino a 1:1.000.000. A causa della distanza filogenetica tra Aves e Mammalia, pollo sono in grado di produrre Ab specifici contro gli antigeni altamente conservato mammiferi in contrasto con i conigli per esempio. La straordinaria quantità di Ab ottenuto IgY tecnologia apre le porte anche per l&#39;utilizzo IgY-Ab nella medicina umana e veterinaria per scopi terapeutici / profilattico.

<ol><li> Dialyse Visking Bag, tipo 27/32, tagliati fuori -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania </li><li> Provette Falcon Blue Max, da 50 ml Provetta conica in polipropilene, Becton Dickinson mediche di laboratorio, Franklin Lakes NY, USA </li><li> Piegato Filtro MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania Heraeus </li><li> Agitatore magnetico, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germania </li><li> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Germania </li><li> Fotometro UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germania </li><li> Polietilene glicole 6000, Rotipuran Ph. Eur.. Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania </li><li> Premiscelato PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania </li><li> Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, Regno Unito </li><li> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, i.Br. Staufen, Germania </li><li> Tuorlo cucchiaio, Fackelmann (effetti houshold), Germania </li></ol>

tecnologia igy: estrazione di anticorpi pollo rosso d&#39;uovo con polietilenglicole (peg) precipitazioni

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Galline possono essere immunizzati per mezzo di im vaccinazione (muscolo pettorale, a destra ea sinistra, volume di iniezione 0,5-1,0 ml) o per mezzo di Gene-Gun plasmide-immunizzazione. Dipende l&#39;immunogenicità dell&#39;antigene, alta anticorpi titoli (fino a 1:100.000 - 1:1.000.000) può essere raggiunto dopo solo uno o 3-4 vaccinazioni spinta. Normalmente, una gallina depone uova ininterrottamente per circa 72 settimane, dopo la diminuzione della capacità di posa. Questo protocollo descrive l&#39;estrazione di IgY totale di tuorlo d&#39;uovo per mezzo di una procedura di precipitazioni (PEG. Polson et al. 1980). Il metodo prevede due passi importanti. Il primo è la rimozione dei lipidi e il secondo è la precipitazione di IgY totale dal surnatante della fase uno. Dopo la dialisi contro un buffer (normalmente PBS) il IgY-estratto può essere conservato a -20 ° C per più di un anno. La purezza del estratto è circa l&#39;80%, il totale per IgY uovo varia da 40-80 mg, dipende dall&#39;età della gallina ovaiola. Il tenore totale di IgY aumenta con l&#39;età della gallina da circa 40 mg / uovo fino a 80 mg / uovo (PEG relative precipitazioni). La capacità di posa di una gallina per anno è di circa 325 uova. Questo significa che un raccolto totale potenziale di 20 g IgY totale / anno sulla base di un contenuto IgY media di 60 mg uovo totale IgY / (vedi tabella 1).

Questo protocollo descrive in particolare l&#39;estrazione di IgY totale di tuorlo d&#39;uovo per mezzo di precipitazione polietilene glicole e fornisce informazioni generali sulla tecnologia IgY.

Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso d&#39;uovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni

Le galline possono essere immunizzate mediante vaccinazione i.m. (Musculus pectoralis, sinistro e destro, volume di iniezione 0,5-1,0 ml) o tramite Gene-Gun...

In questo video verrà mostrata l'isolazione di anticorpi IgY da galline, che possono essere immunizzate con la gomma genica, con un plasmide oppure, in modo più tradizionale, mediante iniezione intramuscolare. In primo luogo, viene isolato il tuorlo d'uovo. Successivamente, i lipidi vengono precipitati, seguiti dalla precipitazione di una frazione proteica contenente gli anticorpi, che vengono poi isolati attraverso un ulteriore passaggio di precipitazione.Infine, gli anticorpi vengono dializzati contro PBS. Sì. Ciao. Mi chiamo Ard. Questo è il mio collega, Adema, e lavoriamo qui nel molto antico e famoso Istituto di Farmacologia, che appartiene alla Medicina Universitaria SHA di Berlino.E di seguito, vorremmo mostrarvi l'estrazione di IGY da uovo di gallina, yogurt, e da un prodotto che riteniamo un metodo molto, molto semplice e anche estremamente economico. Nel complesso, questi metodi appartengono alla cosiddetta tecnologia IGY. Il primo passo nella preparazione dell'IGY è l'isolamento del tuorlo d'uovo.Per questa procedura, abbiamo bisogno di portaprovette, carta da filtro con tappi blu, punte per pipetta, tampone, un becher di vetro, un cucchiaino per separare il tuorlo dall'albume e, naturalmente, le uova. L'uovo viene aperto sopra il cucchiaino per tuorlo per far defluire l'albume. Successivamente, il cucchiaino contenente il tuorlo viene agitato delicatamente per rimuovere la maggior parte dell'albume.Il tuorlo viene quindi trasferito sulla carta da filtro per rimuovere le proteine dell'albume nel modo più completo possibile. La membrana del tuorlo è molto stabile nelle uova, purché non abbiano più di un mese; dopo tre mesi di conservazione, la stabilità diminuisce. La membrana del tuorlo può rompersi a causa del processo di invecchiamento durante il rotolamento sulla carta da filtro.In seguito, la membrana del tuorlo viene aperta con la punta di una pipetta e trasferita in un tubo. Infine, si osserva che il tuorlo ha un volume di circa 15 millilitri. Questo volume è normale per una gallina adulta in fase di deposizione e varia solo minimamente.Il volume del tuorlo viene registrato. Il polietilene glicole al 3,5% viene utilizzato come precipitante in tampone PBS per separare le proteine del tuorlo, inclusa l'IGY, dai lipidi presenti nel tuorlo d'uovo; 1,58 grammi di polietilene glicole, corrispondenti al 3,5% del volume finale di tuorlo e tampone, vengono pesati su una bilancia. I 15 millilitri di tuorlo vengono mescolati con il doppio del volume di tampone PBS, quindi vengono aggiunti 30 millilitri di PBS per un volume finale di 45 millilitri. Il polietilene glicole viene quindi aggiunto alla miscela.Il tubo viene chiuso con il tappo e quindi vortexato accuratamente per 20-30 secondi. Invertire periodicamente il tubo durante la procedura di vortexaggio.Dopo aver agitato con il vortex, il tuorlo dovrebbe essere completamente in sospensione. I tubi vengono ora posizionati su un agitatore rotante per 10 minuti. Il risultato è una miscela omogenea con un colore modificato, da giallo a giallo chiaro.Ora la miscela viene centrifugata per 20 minuti. La centrifugazione separa un sopranatante chiaro contenente IgY e altre proteine da un precipitato giallo, costituito principalmente da lipidi. Nel passaggio successivo, il sopranatante S viene versato attraverso un filtro piegato e trasferito in un nuovo tubo.Il nuovo volume viene registrato e il precipitato viene scartato. A questo punto, nuovamente, il polietilene glicole viene aggiunto al soprannatante a una concentrazione finale del 12%, ovvero il 3,5% nella prima precipitazione più l'8,5% del volume risultante di SNAT, per un totale del 12%. Successivamente, la soluzione viene mescolata, incubata su un agitatore rotante come in precedenza e centrifugata per 20 minuti. A questo punto, il polietilene glicole precipita l'IgY e altre proteine.Dopo questo passaggio di centrifugazione, il pellet verrà utilizzato per la preparazione alla dissoluzione. I bastoncini di vetro del pellet vengono disinfettati con etanolo al 70%; mentre i bastoncini si asciugano, il soprannatante S viene scartato. Successivamente, il tubo viene capovolto per far defluire l'ultima parte del soprannatante.Si aggiunge quindi un millilitro di PBS al pellet. Il pellet viene disciolto utilizzando l'asticella di vetro mentre si esegue una vortexazione completa. Ora si osserva una soluzione leggermente giallastra.Ora, viene aggiunto PBS fino a un volume finale di 10 millilitri, seguito da una terza precipitazione con polietilene glicole alla concentrazione del 12%, come in precedenza, a differenza della seconda centrifugazione. Questa volta, si ottiene un precipitato bianco dopo la centrifugazione per 20 minuti. Il pellet viene solubilizzato nello stesso modo di prima, ma in due passaggi.Nel primo passaggio, viene disciolto in 0,8 millilitri di PBS e trasferito in una capsula di microdialisi. Successivamente, il tubo viene risciacquato con ulteriori 0,4 millilitri di PBS, che vengono anch'essi trasferiti nella capsula. Nel passaggio successivo, un sacchetto da dialisi viene tagliato con forbici disinfettate e risciacquato con acqua distillata.Il sacchetto da dialisi viene quindi posizionato sulla parte inferiore della capsula e chiuso saldamente con la parte superiore. Infine, le capsule vengono trasferite in un becher di vetro posto su un agitatore magnetico. La soluzione di IGY viene dializzata tutta la notte contro soluzione salina allo 0,1%.Il giorno successivo, la soluzione di IGY viene dializzata per tre ore contro PBS. Al termine della dialisi, la membrana di dialisi viene perforata con la punta di una pipetta e la soluzione di IGY viene rimossa e trasferita in un piccolo tubo. Il volume finale viene registrato.Il prodotto finale è una soluzione limpida, che può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per diversi anni. Secondo la nostra esperienza, non conservare il preparato di IGY a meno 70 gradi Celsius poiché abbiamo osservato una significativa perdita di attività a questa temperatura. Bene, speriamo di essere riusciti a convincervi che l'estrazione di IDY da a è una procedura davvero semplice ed efficace se si segue il nostro protocollo.L'attrezzatura necessaria è minima, e riteniamo che esista un rapporto equilibrato tra sforzo e beneficio. Spero che questa pubblicazione video vi incoraggi a sfruttare al meglio il nostro protocollo e anche la tecnologia, come farò io. Grazie.

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In questo video, dimostriamo l'immunoprecipitazione dei fosfopeptidi basata su anticorpi da una miscela di peptidi. I fosfopeptidi arricchiti sono concentrati sotto vuoto e conservati per l'analisi a valle.

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