Una tecnica di citometria a flusso FRET per rilevare l'aggregazione della proteina reporter indotta da semi tau

Prendiamo una coltura cellulare di mammifero che esprime il dominio di ripetizione della proteina tau legante i microtubuli.

Questi reporter tau citoplasmatici possiedono una mutazione incline all'aggregazione ed esistono come monomeri.

I reporter sono fusi con il fluoroforo A o B, con lo spettro di emissione del primo che si sovrappone allo spettro di assorbimento del secondo.

Aggiungere un liposoma complessato con semi di tau o aggregati fibrillari di tau a lunghezza intera.

Entrando nella cellula, il liposoma rilascia i semi nel citoplasma.

I semi rilasciati mediano l'aggregazione dei reporter tau, portando il fluoroforo A vicino al fluoroforo B.

Aggiungere la tripsina per staccare le cellule, quindi eseguire la fissazione.

Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso.

A causa della vicinanza all'interno dell'aggregato, dopo l'eccitazione, il trasferimento di energia dal fluoroforo A al B attraverso un'interazione dipolo-dipolo è indicato come trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza o FRET.

Il fluoroforo B eccitato emette un segnale FRET, la cui presenza indica l'aggregazione proteica.

Per riplaccare le cellule del biosensore in condizioni sterili, scia