Una tecnica di citometria a flusso FRET per rilevare l'aggregazione della proteina reporter indotta da semi tau

Prendiamo una coltura cellulare di mammifero che esprime il dominio di ripetizione della proteina tau legante i microtubuli.

Questi reporter tau citoplasmatici possiedono una mutazione incline all'aggregazione ed esistono come monomeri.

I reporter sono fusi con il fluoroforo A o B, con lo spettro di emissione del primo che si sovrappone allo spettro di assorbimento del secondo.

Aggiungere un liposoma complessato con semi di tau o aggregati fibrillari di tau a lunghezza intera.

Entrando nella cellula, il liposoma rilascia i semi nel citoplasma.

I semi rilasciati mediano l'aggregazione dei reporter tau, portando il fluoroforo A vicino al fluoroforo B.

Aggiungere la tripsina per staccare le cellule, quindi eseguire la fissazione.

Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso.

A causa della vicinanza all'interno dell'aggregato, dopo l'eccitazione, il trasferimento di energia dal fluoroforo A al B attraverso un'interazione dipolo-dipolo è indicato come trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza o FRET.

Il fluoroforo B eccitato emette un segnale FRET, la cui presenza indica l'aggregazione proteica.

Per riplaccare le cellule del biosensore in condizioni sterili, sciacquare ogni linea cellulare con PBS caldo seguito da un'incubazione di 3 minuti con tripsina-EDTA. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con il terreno di coltura caldo e trasferire immediatamente le cellule in una provetta conica.

Centrifugare le celle, rimettendo in sospensione il pellet in terreno fresco. Quindi, contare le cellule ed effettuare una diluizione di 3.500.000 cellule per 13 millilitri di terreno. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire lentamente 130 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo piatto, avendo cura di posizionare i puntali della pipetta al centro dei pozzetti senza toccare il fondo della piastra.

Una volta che le cellule sono state piastrate, lasciarle depositare, indisturbate per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e maggiore o uguale all'80% di umidità relativa. Il giorno successivo, quando le cellule biosensore sono confluenti dal 60% al 65%, combinare il terreno sierico ridotto, il reagente liposomico e la fonte di semi biologici per creare complessi di trasduzione.

Quindi, pipettare delicatamente 20 microlitri di complesso di trasduzione lungo il lato di ogni singolo pozzetto del biosensore e rimettere le cellule trattate nell'incubatore per altre 24-48 ore. Prima del prelievo, le cellule non trattate mostreranno solo una fluorescenza diffusa. Tuttavia, le cellule trattate con materiale di semi tau mostreranno aggregati luminosi dopo 1 o 2 giorni.

Per raccogliere le cellule, sostituire il terreno di coltura cellulare con 50 microlitri di tripsina-EDTA, interrompendo la reazione dopo 5 minuti con 150 microlitri di terreno di coltura refrigerato. Immediatamente, trasferire le celle in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti e pellettare le cellule. Aspirare il surnatante senza disturbare i pellet, quindi risospendere delicatamente ma accuratamente le cellule in 50 microlitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti. Quindi, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso refrigerato.