JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:22 min • July 8th, 2025
Iniziare con una provetta contenente vettori separati per i geni degli anticorpi a catena pesante e a catena leggera.
Aggiungere un reagente di trasfezione per formare complessi con i vettori.
Trasferire questa miscela alle cellule ospiti dei mammiferi e incubare per l'internalizzazione.
Aggiungere un agente antiaggregante per promuovere la distribuzione uniforme delle cellule trasfettate, migliorando il recupero e la crescita cellulare.
Aggiungere una soluzione antibatterica-antimicotica per prevenire la contaminazione.
All'interno della cellula ospite, i vettori si integrano nel genoma ospite.
Dopo la trascrizione genica, i singoli mRNA escono dal nucleo e subiscono la traduzione per formare catene anticorpali nascenti.
La corretta piegatura e modifica delle catene nascenti produce catene pesanti e leggere.
Queste catene si combinano per formare anticorpi completamente funzionali, che vengono poi rilasciati nel mezzo extracellulare.
Raccogliere il terreno e centrifugare. Filtrare il surnatante.
Far passare il filtrato attraverso una colonna di purificazione che permette il legame selettivo degli anticorpi.
Utilizzando un tampone di eluizione, eluire gli anticorpi purificati.
Coltiva le cellule CHO in 200 millilitri di terreno in lunghi flaconi deflettori di Erlenmeyer. Combina 5 millilitri di CHO freestyle media con 50 microgrammi di DNA clone pesante variabile e 75 microgrammi di DNA clone leggero variabile in una provetta da 15 millilitri. Quindi, fai vorticare il tubo. Lasciare il composto a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 750 microlitri di 1 milligrammo per millilitro di polietilene ammina alla soluzione di DNA e agitarla in modo aggressivo per 30 secondi.
Lasciare il composto a temperatura ambiente per altri 5 minuti. Aggiungere l'intera miscela alle cellule CHO agitando manualmente il pallone. Incubare immediatamente le cellule a 37 gradi Celsius agitando a 130 giri/min.
Il giorno successivo, aggiungere 2 millilitri di agente antiaggregante 100x e 2 millilitri di soluzione antimicotica antibatterica 100x alle cellule. Incubare i palloni a 32-34 gradi Celsius agitando a 130 giri/min. Continuare a coltivare le cellule per 10-11 giorni, aggiungendo 10 millilitri di triptone N1 e 2 millilitri di integratore di glutammina 100x ogni cinque giorni. Contare le cellule ogni tre giorni per assicurarsi che la vitalità cellulare rimanga superiore all'80%. Il giorno 10 o 11, raccogliere il terreno per la purificazione degli anticorpi centrifugando la coltura a 3.000 volte g e 4 gradi Celsius per 40-60 minuti. Quindi, filtrare il materiale trasparente con un filtro per bottiglie da 0,22 micrometri.
Per purificare gli anticorpi, equilibrare la colonna proteica A con due volumi di colonna di tampone legante. Far passare il materiale filtrato attraverso la colonna alla velocità di flusso di 1 millilitro al minuto. Quindi lavare la colonna con due volumi di colonna di tampone di legatura. Utilizzare 5 millilitri di tampone di eluizione per eluire l'anticorpo in frazioni da 500 microlitri.