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Immunologia
0 visualizzazioni • 2:10 min • July 8th, 2025
Preparare una miscela di trasfezione aggiungendo un polimero cationico appropriato e separare i vettori plasmidici per i geni degli anticorpi a catena pesante e a catena leggera.
Il polimero caricato positivamente si lega con i plasmidi caricati negativamente, formando complessi.
Aggiungere questa miscela di trasfezione a una piastra a più pozzetti contenente una coltura di cellule renali embrionali umane in un terreno privo di siero e incubare.
I complessi entrano nelle cellule attraverso l'endocitosi, causando gonfiore e rottura endosomiale, rilasciandoli nel citoplasma.
Il polimero cationico produce pori nella membrana nucleare, facilitando l'ingresso del vettore e consentendo la loro trascrizione, seguita dalla traduzione in proteine a catena pesante e leggera.
Queste proteine si spostano nel reticolo endoplasmatico, dove le proteine a catena pesante e leggera vengono dimerizzate e legate covalentemente da legami disolfuro, formando anticorpi.
Gli anticorpi viaggiano verso l'apparato di Golgi per ulteriori modifiche post-traduzionali e vengono impacchettati in vescicole per il rilascio extracellulare.
Raccogliere il terreno contenente gli anticorpi rilasciati. Aggiungere un terreno privo di siero per la generazione continua di anticorpi.
Preparare le cellule HEK in DMEM integrato e farle crescere fino al 75% di confluenza in fiasche di coltura da 75 centimetri quadrati. Per ogni trasfezione di catene pesanti/leggere, preparare una miscela con 1,75 millilitri di DMEM senza siero. Includere 4,5 microgrammi di vettore a catena pesante, 3 microgrammi di vettore a catena leggera e 50 microlitri di soluzione di polietilenimmina. Aggiungere delicatamente questa miscela a una piastra di cellule HEK e far roteare la soluzione sulla piastra.
Incubare la piastra durante la notte, quindi iniziare a raccogliere il terreno di coltura ogni giorno, sostituendolo con un terreno privo di siero. Il terreno contiene gli anticorpi e può essere raccolto quotidianamente per quattro giorni.