Una tecnologia di ibridomi per la produzione di anticorpi monoclonali contro una metallopeptidasi

Prendete un topo immunizzato con una metallopeptidasi. Raccogliere la milza e ottenere una sospensione cellulare.

Filtrare la sospensione attraverso una rete e centrifugare, rimuovendo i detriti di tessuto.

Le cellule isolate includono cellule B specifiche per la metallopeptidasi, che producono anticorpi contro gli epitopi della metallopeptidasi.

Si aggiungano cellule di mieloma immortale prive dell'enzima HGPRT, impedendo il recupero delle basi nucleotidiche per la sintesi nucleotidica. Sopravvivono attraverso la sintesi nucleotidica de novo.

Centrifugare per ottenere un pellet e scartare il surnatante.

Aggiungere PEG e incubare, inducendo la fusione delle cellule del mieloma-B per formare ibridomi immortali HGPRT-positivi.

Aggiungere il terreno HAT composto da ipoxantina, aminopterina e timidina. Trasferimento in pozzetti contenenti uno strato di alimentazione peritoneale dei macrofagi, che favorisce la crescita degli ibridomi.

L'aminopterina blocca la sintesi nucleotidica de novo, causando la morte delle cellule di mieloma non fuse. Le cellule B non fuse muoiono a causa della loro breve durata di vita.

Gli ibridomi HGPRT-positivi recuperano i precursori nucleotidici ipoxantina e timidina, proliferano e secernono anticorpi monoclonali specifici per la metallopeptidasi.

Raccogliere il surnatante per confermare la produzione di anticorpi tramite saggi a valle.

Per iniziare, iniettare intraperitonealmente 100 microgrammi di proteina APM nei topi femmina adulta selezionati per un potenziamento finale dell'antigene. Dopo 3 giorni dall'iniezione, raccogliere la milza dai topi e lavare due volte con DMEM per rimuovere il sangue e le cellule adipose.

Filtrare la sospensione cellulare della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione per rimuovere la membrana della milza. Seminare le cellule di mieloma SP2/0 di topo in una fiaschetta di 25 centimetri quadrati contenente 5 millilitri di DMEM integrato con il 6% di siero fetale bovino e coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica in atmosfera per mantenere la vitalità cellulare.

Dopo 5-6 giorni di coltura, le cellule dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza dopo la rianimazione e apparire rotonde, luminose e chiare al microscopio. Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi.

Seminare i macrofagi peritoneali a una densità compresa tra 0,1 e 0,2 volte 10 al quinto per millilitro in piastre a 96 pozzetti, ciascuna contenente 100 microlitri di terreno HAT, e incubarli durante la notte. Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP2/0 con una pipetta da 8 a 10 flaconi e risospenderle in 10 millilitri di terreno DMEM privo di siero.

Lavare le cellule con DMEM fresco e centrifugarle due volte, quindi risospenderle in 10 millilitri di DMEM. Mescolare le cellule quantificate della milza con le cellule SP2/0 in un rapporto di 10 a 1 e trasferirle in provette da 50 millilitri.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e raccogliere i pellet sul fondo delle provette. Picchiettare il tubo per allentare i pellet prima dell'ibridazione. Utilizzando un contagocce, aggiungere 1 millilitro di polietilenglicole 1.500 preriscaldato a 37 gradi Celsius goccia per goccia al pellet di cellule allentate nell'arco di 45 secondi, ruotando delicatamente il fondo del tubo.

Quindi, aggiungere lentamente 1 millilitro di DMEM preriscaldato a 37 gradi Celsius alla miscela per 90 secondi, seguito da altri 30 millilitri di DMEM fresco, e posizionare il tubo di fusione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule. Risospendere il terreno HAT e la coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali. Dopo 5 giorni, aggiungere 100 microlitri di terreno HAT fresco in ogni pozzetto. E ancora, dopo 5 giorni di incubazione, sostituire il terreno con un terreno HT. Utilizzare una piastra per microtitolazione rivestita con 5 microgrammi per millilitro di proteina APN diluita in PBS 0,05 molari per analizzare gli anticorpi monoclonali nel surnatante dell'ibridoma utilizzando un test ELISA.