JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:32 min. • July 8th, 2025
Prendi una sospensione di cellule natural killer, o NK.
Aggiungere anticorpi monoclonali anti-CD20 e incubare.
In assenza di cellule tumorali bersaglio che esprimono l'antigene CD20, la regione Fc degli anticorpi si lega ai recettori FcγRIIIa sulla superficie delle cellule NK.
Dopo l'incubazione, aggiungere terreno refrigerato. Centrifugare e rimuovere gli anticorpi non legati.
Quindi, aggiungi gli anticorpi anti-catene leggere κ umane. Incubare.
Questi anticorpi secondari si legano alla catena leggera κ degli anticorpi monoclonali.
La reticolazione dell'anticorpo imita il legame dell'antigene bersaglio, innescando una cascata di segnalazione intracellulare.
Ciò provoca la stimolazione artificiale delle cellule NK in assenza di cellule tumorali.
Le cellule NK attivate subiscono un riarrangiamento citoscheletrico e rilasciano granuli citotossici.
Inoltre, le cellule producono chemochine e citochine.
Dopo la durata desiderata, aggiungere terreni refrigerati per interrompere la stimolazione cellulare.
Centrifugare la provetta. Raccogliere il surnatante e il pellet cellulare per l'analisi a valle delle funzioni delle cellule NK effettrici mediate da anticorpi.
Erogare 100 microlitri di cellule natural killer risospese in provette da 1,5 millilitri o in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti e posizionare le cellule sul ghiaccio. Preparare rituximab o altri anticorpi di interesse a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro.
Aggiungere 1 microlitro a ciascuna provetta di cellule per una concentrazione finale di 1 microgrammo per millilitro e incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare una soluzione di anticorpo anti-catena leggera kappa umana in terreno a una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro. La quantità di soluzione anticorpale necessaria sarà di 50 microlitri per campione di cellule.
Riscaldare la soluzione di anticorpi a 37 gradi Celsius su un blocco termico o a bagnomaria. Al termine dell'incubazione delle cellule, aggiungere 1 millilitro di terreno ghiacciato a ciascuna provetta e centrifugare le cellule a 135 volte g e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Lavare nuovamente le celle con 1 millilitro di terreno ghiacciato. Aspirare il surnatante dopo l'ultimo lavaggio e aggiungere 50 microlitri della soluzione anticorpale anti-catena leggera kappa umana per attivare le cellule. Posizionare immediatamente i campioni di cellule a 37 gradi Celsius su un blocco termico o in un bagno d'acqua e incubarli fino ai punti temporali desiderati per l'analisi o altre procedure.
Il modo migliore per gestire più campioni è utilizzare un rack galleggiante in un bagno d'acqua a 37 gradi, che può essere rimosso e posizionato sul ghiaccio per interrompere immediatamente tutte le reazioni.