Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

Prendiamo i vettori di espressione eucariotici, che codificano per una catena pesante di anticorpi o una catena leggera di anticorpi, clonati da cellule B antigene-specifiche.

Introdurre la polietilenimmina, un polimero cationico, che interagisce elettrostaticamente con i vettori caricati negativamente, formando poliplex.

Incubare le cellule di mammifero con i poliplessi, che aderiscono alle cellule e vengono internalizzati tramite endocitosi. Gli endosomi risultanti si fondono con i lisosomi.

I polimeri nei poliplessi causano il rigonfiamento osmotico della vescicola, portando alla sua rottura e al rilascio dei vettori.

I vettori rilasciati entrano nel nucleo e vengono trascritti in mRNA a catena pesante e a catena leggera, che subiscono la traduzione tramite ribosomi sul reticolo endoplasmatico.

Le catene peptidiche risultanti si assemblano in anticorpi, che vengono trasportati al Golgi e impacchettati in vescicole secretorie.

Dopo la fusione delle vescicole secretorie e della membrana cellulare, gli anticorpi vengono rilasciati extracellularemente.

Raccogliere il surnatante contenente anticorpi per i saggi a valle.

Semina 15.000 cellule renali embrionali umane in 200 microlitri di Dulbecco's Modified Eagle Medium integrato con il 10% di siero fetale bovino in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, un giorno prima della trasfezione. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte al 5% di anidride carbonica. Cotrasfettare le cellule utilizzando un reagente di trasfezione derivato dalla polietilenimmina lineare. Diluire 0,5 microlitri di reagente di trasfezione del DNA con 10 microlitri di 150 millimolari di cloruro di sodio.

Successivamente, diluire 0,125 microgrammi di ciascun vettore variabile che esprime catene pesanti e leggere in 10 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari. Agitare tutte le diluizioni per 10 secondi ciascuna. Quindi, mescolare il reagente di trasfezione del DNA precedentemente diluito con 10 microlitri di soluzione di DNA. Agitare rapidamente la miscela di trasfezione del DNA per 15 secondi e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere la miscela di trasfezione del DNA goccia a goccia sulle cellule, quindi agitare delicatamente la piastra. Sostituire il terreno 16 ore dopo la trasfezione e coltivare le cellule per cinque giorni in terreno privo di siero a 37 gradi Celsius.