JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:28 min. • July 8th, 2025
Prendi una colonna FPLC contenente una resina di vetro porosa con proteina A immobilizzata, una proteina batterica legante gli anticorpi. Equilibrare la colonna con un tampone a pH neutro.
Aggiungere il liquido di coltura cellulare raccolto da cellule ovariche di criceto cinese, contenente anticorpi monoclonali e proteine e DNA contaminanti.
La proteina A si lega alla regione Fc dell'anticorpo, immobilizzandola.
Alcuni contaminanti si attaccano in modo non specifico alla resina, mentre il resto scorre attraverso.
Nel cromatogramma, un aumento dell'assorbanza UV durante il caricamento del campione indica un'elevata concentrazione di proteine nel flusso attraverso.
Lavare con il tampone di equilibratura per rimuovere i contaminanti non legati, indicati da una diminuzione dell'assorbanza.
Sciacquare con un tampone ad alto contenuto di sale, interrompendo le interazioni non specifiche e rimuovendo i contaminanti, indicati da un piccolo picco di impurità.
Aggiungere un tampone di eluizione a basso pH per interrompere l'interazione proteina A-anticorpo ed eluire gli anticorpi, che vengono raccolti tracciando il picco corrispondente.
Neutralizzare il pH degli anticorpi raccolti per preven
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