JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:28 min. • July 8th, 2025
Prendi una colonna FPLC contenente una resina di vetro porosa con proteina A immobilizzata, una proteina batterica legante gli anticorpi. Equilibrare la colonna con un tampone a pH neutro.
Aggiungere il liquido di coltura cellulare raccolto da cellule ovariche di criceto cinese, contenente anticorpi monoclonali e proteine e DNA contaminanti.
La proteina A si lega alla regione Fc dell'anticorpo, immobilizzandola.
Alcuni contaminanti si attaccano in modo non specifico alla resina, mentre il resto scorre attraverso.
Nel cromatogramma, un aumento dell'assorbanza UV durante il caricamento del campione indica un'elevata concentrazione di proteine nel flusso attraverso.
Lavare con il tampone di equilibratura per rimuovere i contaminanti non legati, indicati da una diminuzione dell'assorbanza.
Sciacquare con un tampone ad alto contenuto di sale, interrompendo le interazioni non specifiche e rimuovendo i contaminanti, indicati da un piccolo picco di impurità.
Aggiungere un tampone di eluizione a basso pH per interrompere l'interazione proteina A-anticorpo ed eluire gli anticorpi, che vengono raccolti tracciando il picco corrispondente.
Neutralizzare il pH degli anticorpi raccolti per prevenirne la degradazione.
Iniziare aprendo il software collegato al sistema di purificazione e posizionando tubi conici da 15 millilitri per raccogliere l'eluato di anticorpi purificati e tubi conici da 50 millilitri per raccogliere il flusso durante il lavaggio ad alto contenuto di sale nel collettore di frazioni.
Quindi, aggiungere il liquido di coltura cellulare raccolto filtrato con poro da 0,22 micrometri a una siringa vuota da 12 millilitri con un ugello tappato. Dopo aver rimosso il tappo, inserire l'ugello della siringa nella porta di iniezione manuale del sistema di purificazione. Ruotare la siringa per stringerla in posizione e premere lo stantuffo fino a quando l'intero volume del campione non è stato iniettato ed è visibile nell'ansa del campione di grande volume da 10 millilitri collegata.
Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento. Quando tutto l'anticorpo è stato eluito, neutralizzare immediatamente la proteina purificata con 1 tris base molare a un pH di circa 5,5.