Un test per rilevare gli autoanticorpi nel siero umano utilizzando una coltura neuronale ippocampale

Prendi l'embrione di ratto ippocampo.

Aggiungere la tripsina. Incubare per mediare la rottura della matrice tissutale, allentando le cellule dell'ippocampo.

Diluire con un tampone. Incubare per la digestione enzimatica continua con tripsina.

Quindi, trasferire la massa di tessuto in una provetta contenente terreno. Pipettare ripetutamente per la dissociazione meccanica in singole cellule.

Cellule di semina su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina all'interno di piastre di coltura.

incubare. Le cellule dell'ippocampo aderiscono alle superfici rivestite. I neuroni sviluppano una lamella ed estendono i neuriti minori.

Inoltre, i neuriti crescono con processi assonali e dendritici, formando una rete neuronale.

I neuroni maturi esprimono recettori eccitatori sinaptici, recettori N-metil-D-aspartato o NMDAR.

Dopo l'incubazione, lavare i vetrini coprioggetti con un terreno.

Aggiungere un siero diluito per pazienti affetti da encefalite autoimmune. Gli autoanticorpi si legano agli NMDAR neuronali.

Lavare con tampone e poi fissare le celle.

Aggiungere anticorpi secondari marcati con fluorofori che si legano agli autoanticorpi legati a NMDAR.

Lavare con tampone. Posizionare il vetrino coprioggetti su un supporto di montaggio contenente DAPI per colorare i nuclei.

Osservare al microscopio i segnali di fluorescenza sui neuroni, indicando la presenza di autoanticorpi nel siero.

Per la dissociazione enzimatica dell'ippocampo a 1 millilitro di tripsina al 2,5% nella provetta da 50 millilitri contenente l'ippocampo, dopo aver portato il volume nella provetta a 5 millilitri con HBSS, incubare la provetta per 15 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Per diluire ulteriormente la tripsina, aggiungere 10 millilitri di HBSS preriscaldato e rimettere il tubo nel bagnomaria impostato a 37 gradi Celsius per 5 minuti.

Successivamente, utilizzare una micropipetta da 1.000 microlitri per trasferire l'ippocampo che appare come una massa mucosa in una provetta da 50 millilitri e incubare il tessuto con 6 millilitri di HBSS preriscaldato per 5 minuti, come dimostrato. Per dissociare meccanicamente il tessuto, trasferire la massa ippocampale in un tubo da 2 millilitri con fondo conico. Dopo aver aggiunto 1 millilitro di terreno DMEM preriscaldato, omogeneizzare il pellet con una micropipetta da 1.000 microlitri aspirando delicatamente su e giù.

Per non creare bolle, ripetere l'aspirazione su e giù da 10 a 20 volte con una pipetta di vetro pre-tirata, con la punta a contatto con il fondo conico del tubo, fino a quando la miscela non è traslucida. Contare le cellule prima di distribuirle uniformemente su un piatto di 3,5 centimetri con movimenti di scuotimento incrociato. Una volta fatto, mettere il piatto nell'incubatrice con il 5% di anidride carbonica.

Per l'immunocolorazione fluorescente di cellule in vitro per 14 giorni, aggiungere il campione contenente anticorpi anti-NMDAR ai vetrini coprioggetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo un'ora, trattare il campione con formaldeide al 4% in PBS, come soluzione di fissaggio, a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi lavare il campione tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno, seguito dall'aggiunta dell'anticorpo secondario capra anti-umano Alexa Fluor 488 a una diluizione da 1 a 1.000 per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, montare i vetrini coprioggetti contenenti il campione con un mezzo di montaggio del liquido e aspirare il liquido rimanente.