JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:01 min • July 8th, 2025
Assumere siero umano diluito in serie, inattivato termicamente, contenente virus respiratorio sinciziale o anticorpi neutralizzanti specifici per RSV.
Aggiungere la sospensione virale. Gli anticorpi neutralizzano i virus in modo dipendente dalla diluizione.
Introdurre la miscela in monostrati di cellule epiteliali umane e incubare per l'adsorbimento virale.
Scartare il composto. Aggiungere terreni contenenti carbossimetilcellulosa, formando un rivestimento semisolido. Incubare.
L'RSV utilizza il macchinario della cellula ospite per sintetizzare l'RNA e le proteine virali, che successivamente si assemblano e germogliano come singoli virioni.
Le cellule infette alla fine muoiono. La carbossimetilcellulosa limita il movimento del virus, causando infezioni localizzate e morte cellulare, formando placche.
Rimuovere la sovrapposizione.
Fissare le celle con un tampone contenente acetone. Introdurre un tampone bloccante contenente detergente per permeabilizzare le cellule e prevenire interazioni anticorpali non specifiche.
Aggiungere anticorpi primari mirati alle proteine virali.
Sovrapposizione con anticorpi secondari coniugati con fluorofori mirati agli anticorpi primari.
Visualizzare i pozzetti per quantificare le placche fluorescenti.
La più alta diluizione sierica che neutralizza il cinquanta percento di RSV rappresenta il titolo di neutralizzazione.
Prima dell'inoculazione delle cellule A549 con RSV, esaminare la piastra cellulare al microscopio ottico per confermare che i monostrati cellulari A549 sono confluenti all'80%. Quindi, capovolgere delicatamente la lastra per eliminare il supporto e tamponare leggermente la lastra su un tovagliolo di carta sterile e assorbente. Dopo ogni lavaggio con PBS filtrato e sterile.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri per pozzetto della miscela virus-siero ai pozzetti corrispondenti sulla piastra cellulare A549 secondo il modello di piastra fornito nel manoscritto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un'ora. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per rimuovere 90 microlitri per pozzetto e aggiungere 100 microlitri di terreno contenente 1X M 199, 1,5% CMC e 2% FCS e miscela penicillina-streptomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre giorni.
Per fissare e sviluppare una piastra di analisi, capovolgere delicatamente la piastra cellulare A549 infettata da RSV per scartare i terreni contenenti M 199, CMC, 2% FCS e miscela penicillina-streptomicina. Quindi, aggiungere lentamente 200 microlitri di tampone di fissazione a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, scartare il tampone di fissazione e tamponare delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente.
Lasciare asciugare la piastra a faccia in giù per 10 minuti. Quindi, con tampone PBS filtrato contenente 0,05 polisorbato-20, preparare una soluzione bloccante il latte al 5%. Aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, capovolgere delicatamente la piastra per eliminare la soluzione e tamponare su un tovagliolo di carta assorbente.
Per produrre l'anticorpo primario, diluire da 1 a 500 anticorpi Goat X RSV nella soluzione bloccante. Aggiungere 50 microlitri a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare la piastra tre volte con polisorbato PBS filtrato.
Successivamente, produrre l'anticorpo secondario diluendo da 1 a 5.000 AlexaFluor Donkey anti-Goat immunoglobulina G nella soluzione bloccante. Aggiungere 50 microlitri a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare la piastra cinque volte con polisorbato PBS filtrato.
Per contare le placche con un lettore automatico di spot, utilizzare innanzitutto una piastra di coltura a 96 pozzetti inutilizzata per calibrare lo strumento inserendo le impostazioni di conteggio nel canale FITC. Quindi, leggi la piastra cellulare, avvolgila in un foglio e conservala a 4 gradi Celsius. Quindi, controllare le immagini dei pozzetti per placche artefatte o monostrati cellulari interrotti ed escludere i pozzetti con monostrati cellulari interrotti.