Rilevamento di autoanticorpi delle isole umane mediante un saggio di elettrochemiluminescenza

Per rilevare gli autoanticorpi delle isole – un biomarcatore del diabete di tipo 1 – prelevare campioni di siero umano e aggiungere acido acetico per inibire i componenti interferenti.

Incubare e poi aggiungere un tampone alcalino per neutralizzare l'acido.

Trasferire il siero trattato in una piastra a più pozzetti contenente una miscela di autoantigeni umani delle isole di panciola, tra cui antigeni a cattura biotinilata e antigeni coniugati con rutenio, ciascuno a una concentrazione ottimale per il saggio.

L'autoanticorpo delle isole nel campione positivo collega l'antigene coniugato con rutenio all'antigene di cattura biotinilato, formando un complesso antigene-anticorpo.

Trasferire la miscela in una piastra di elettrochemiluminescenza rivestita di streptavidina pretrattata con un agente bloccante e dotata di elettrodi di lavoro e controelettrodi.

Incubare per consentire interazioni del complesso biotinilato con la streptavidina legata e quindi lavare.

Aggiungere un tampone contenente tripropilammina o TPA.

In uno strumento di elettrochemiluminescenza, l'applicazione di tensione tra gli elettrodi avvia l'ossidazione del rutenio e del TPA, generando radicali TPA.

I radicali TPA eccitano i complessi di rutenio, che emettono fotoni mentre tornano al loro stato fondamentale.

Un'elevata chemiluminescenza nel campione positivo indica la presenza di autoanticorpi insulari.

Mescolare l'autoantigene delle isole umane con la biotina o il sulfo-tag in rapporto molare 1:5 in una provetta e coprire la provetta con un foglio di alluminio poiché entrambe le etichette sono sensibili alla luce. Quindi, incubare la provetta per un'ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, quando l'incubazione è in corso, innescare la colonna di centrifuga con soluzione salina tamponata con doppio fosfato.

Quindi, centrifugare la colonna a 1.000 volte g per due minuti ogni volta. Quindi, centrifugare la miscela di etichette autoantigene nella colonna di centrifuga a 1.000 volte g per 2 minuti. Quindi, aliquotare e conservare l'antigene marcato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Successivamente, utilizzare la concentrazione razionale dell'antigene marcato con biotina sulfo-tag in base al saggio a scacchiera per il tampone antigenico per preparare 3 millilitri di soluzione antigenica per piastra a 96 pozzetti.

Quindi, in ogni pozzetto, aggiungere 4 microlitri di siero e regolare il volume finale a 20 microlitri con soluzione salina tamponata con fosfato 1 volta. Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione antigenica marcata in ciascun pozzetto e coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare la luce. Quindi, trasferire il piatto su uno shaker a temperatura ambiente per 2 ore.

Una volta che lo shaker si ferma, lasciare il piatto a 4 gradi Celsius in frigorifero per 18-24 ore. Ora, mescola 15 microlitri di siero con 18 microlitri di acido acetico 0,5 molare per ogni campione e incuba lo stesso a temperatura ambiente per 45 minuti.

Sulla base del test a scacchiera, utilizzare la concentrazione razionale dell'antigene marcato con biotina sulfo-tag per preparare la soluzione antigenica.

Quindi, aliquotare 35 microlitri di tampone antigenico in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR. Poco prima che il coro di incubazione della miscela di siero sia completato, aggiungere 3,8 microlitri di tampone Tris da 1 molare a pH nove lungo il lato di ciascun pozzetto sulla piastra dell'antigene.

Una volta terminata l'incubazione, trasferire rapidamente 25 microlitri di siero trattato con acido acetico in ciascun pozzetto della piastra dell'antigene e agitare la soluzione. Quindi, coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce e posizionarla su uno shaker a temperatura ambiente per 2 ore. Una volta fatto, trasferisci la piastra a 4 gradi Celsius in frigorifero e incuba per 18-24 ore.

Togli la piastra per streptavidina dal frigorifero a 4 gradi Celsius e lascia che la piastra raggiunga la temperatura ambiente. Dopo che la piastra per streptavidina ha raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere 150 microlitri di bloccante A al 3% in ciascun pozzetto, coprire la piastra PCR con un foglio sigillante e incubare in frigorifero per una notte.

Il giorno successivo, rimuovere la piastra di streptavidina dal frigorifero ed espellere il tampone dai pozzetti. Quindi, asciugare il piatto appoggiandolo a testa in giù su alcuni tovaglioli di carta asciutti per l'ammollo del tampone rimanente. Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone PBST 1-fold per lavare il pozzetto per tre lavaggi consecutivi.

Quindi, trasferire 30 microlitri di antigene sierico incubare in ciascun pozzetto della piastra per streptavidina e coprire la piastra con un foglio per evitare la luce. Quindi, trasferire il piatto su uno shaker a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, scartare l'antigene sierico incubato dalla piastra e aggiungere 150 microlitri di tampone PBST 1 volta per lavare il pozzetto tre volte. Una volta terminato il lavaggio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura in ogni pozzetto da leggere su un lettore di piastre.