Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è misurare le proprietà meccaniche dell'interfaccia tra il nucleo cellulare e la sua connessione fisica con il citoscheletro circostante. Questo viene ottenuto applicando una deformazione meccanica a cellule seminate su una membrana di silicone trasparente e acquisendo immagini delle deformazioni nucleari indotte. Deformazioni nucleari maggiori corrispondono a una rigidità nucleare ridotta, poiché variazioni nell'accoppiamento nucleo-citoscheletrico possono influenzare anche le deformazioni nucleari indotte.

La trasmissione delle forze intracellulari tra citoscheletro e nucleo viene analizzata direttamente applicando una deformazione localizzata al citoscheletro. Successivamente, viene effettuata un'immagine dello spostamento delle strutture nucleari NU e del citoscheletro marcate con fluorescenza. I risultati ottenuti mostrano la rigidità dei nuclei cellulari in relazione al citoscheletro circostante.

In base agli esperimenti di deformazione del substrato, il saggio di manipolazione dei microaghi rivela che l'alterazione dell'accoppiamento nucleo-citoscheletrico provoca difetti nella trasmissione delle forze intracellulari. Il principale vantaggio di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti, come l'aspirazione con micropipetta di nuclei isolati, è che consentono la misurazione della meccanica nucleare in cellule vive integre senza alterare l'architettura cellulare normale. Questi metodi possono fornire informazioni su come i cambiamenti nella composizione dell'involucro nucleare possano influenzare le proprietà meccaniche del nucleo.

Possono inoltre essere utilizzati per studiare il ruolo della meccanica nucleare nel contesto di malattie come le neuropatie da LA o il cancro. Ogni piatto per stiramento è costituito da un piatto di plastica senza fondo, su misura, con un diametro di tre pollici e un anello di plastica ad O per fissare una membrana di silicone, che funge da substrato per la coltura cellulare. Per la preparazione del piatto per stiramento, fissare tra un anello ad O e il piatto un quadrato di membrana di silicone di quattro pollici per quattro pollici, rimuovere con cura la membrana in eccesso, risciacquare il piatto per stiramento con acqua deionizzata, quindi sterilizzare il piatto in autoclave prima di rivestire la membrana di silicone con molecole della matrice extracellulare e segnare un punto di riferimento all'esterno della membrana al centro del fondo.

Questo punto di riferimento aiuterà a identificare le stesse cellule durante gli esperimenti di deformazione per l'applicazione di una sollecitazione uniaxiale. Vengono applicate due strisce parallele di nastro adesivo intorno al punto di riferimento per limitare la formazione della membrana in una dimensione. Per garantire un ottimale attaccamento cellulare, rivestire le membrane di silicone con tre microgrammi per millilitro di fibronectina o qualsiasi altra proteina della matrice extracellulare adatta.

Coprire la piastra con una piastra capovolta in polistirene da 10 centimetri e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare la membrana una volta con PBS per rimuovere le proteine in eccesso. Riempire la piastra con 10 millilitri di mezzo di crescita e mettere da parte.

Dopo aver preparato la piastra con membrana di silicone rivestita, trattare le cellule con tripsina al 0,05% e seminare le cellule aderenti sulla piastra in mezzo di crescita. Questa procedura viene dimostrata con embrioni di topo.

I fibroblasti o le cellule mes incubano le cellule per 24-48 ore in condizioni di coltura normali. Un microscopio invertito predisposto per esperimenti di deformazione del substrato include un dispositivo di deformazione costituito da una piastra di base che si adatta alla piastra del microscopio. La piastra contiene un cilindro centrale in platino, che serve ad applicare una deformazione alla sezione centrale della membrana in silicone.

Il dispositivo dispone inoltre di una piastra mobile che sostiene la piastra di trazione e può scorrere verso l'alto e verso il basso su quattro perni di guida, nonché di un peso da cinque libbre per applicare un carico. Per visualizzare i nuclei, incubare le cellule nella piastra di trazione con un microgrammo per millilitro di colorante Hoechst per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo e sostituirlo con 15 millilitri di mezzo di crescita privo di rosso fenolo contenente 25 millimoli di HEPES.

Quindi avvitare la piastra nel supporto della piastra e applicare con attenzione del grasso sul perimetro della parte inferiore della membrana in silicone per garantire lo scorrimento della membrana lungo il platino centrale. Assicurarsi di mantenere libera la sezione centrale della membrana. Posizionare la piastra di base sulla piastra del palchetto del microscopio e montare con cura il supporto della piastra sulla piastra di base.

Assicurarsi che nella posizione iniziale di riposo, la membrana di silicone della piastra da stiramento giaccia in modo lento sulla piastra centrale. Successivamente, mettere a fuoco il fondo della membrana di silicone e individuare il punto di riferimento nero centrale. Tale punto servirà come punto di partenza per tutte le acquisizioni di immagini e facilita il ritrovamento delle stesse cellule durante e dopo lo stiramento.

In questa immagine, il punto centrale occupa l'intero campo visivo. Partendo dal bordo del punto, regolare la messa a fuoco per visualizzare le cellule e la superficie della membrana di silicone. Individuare cellule ben distese con nuclei posizionati al centro.

Acquisire un'immagine con contrasto in campo chiaro, che deve essere focalizzata sul contorno cellulare e sulla membrana di silicone. Successivamente, acquisire un'immagine a fluorescenza della colorazione del gancio nucleare nu, che deve essere focalizzata sul piano centrale del nucleo. Dopo aver acquisito le immagini di cinque a quindici cellule, tornare al punto centrale.

Applicare lentamente il peso alla piastra di deformazione, ottenendo un'applicazione uniforme della deformazione. Al centro della piastra. La deformazione massima applicata al substrato è limitata da distanziatori in nylon posizionati sui perni di allineamento verticale dopo l'applicazione della deformazione; focalizzare il microscopio sul fondo della membrana in silicone e individuare nuovamente il punto di riferimento, partendo dal punto stesso.

Spostare le stesse cellule e acquisire nuovamente un'immagine in contrasto di fase e alla fine un'immagine di fluorescenza di ciascuna cellula nel nucleo sotto piena deformazione, cercando di corrispondere il più possibile ai piani focali delle immagini iniziali. Questo processo non deve superare i 10 minuti per evitare il rimodellamento attivo e l'adattamento della cellula al substrato estraneo. Dopo aver acquisito tutte le immagini corrispondenti, riportare la piastra del microscopio al punto di partenza.

Rimuovere con attenzione il peso dalla piastra del portapiatto e, se necessario, lasciare rilassare la membrana di silicone. Spingere delicatamente verso l'alto il piatto di deformazione fino a riportarlo alla posizione iniziale. Quindi acquisire le immagini in contrasto di fase e in fluorescenza.

Le immagini delle cellule dopo la deformazione, ottenute esattamente come descritto per le immagini della deformazione, insieme alle immagini delle cellule e dei nuclei marcati fluorescentemente prima, durante e dopo l'applicazione della deformazione, vengono analizzate per calcolare la deformazione nucleare normalizzata. In questa dimostrazione, per l'analisi viene utilizzato uno script MATLAB sviluppato ad hoc, ma esistono diverse alternative per calcolare manualmente la deformazione del substrato applicata, confrontando le posizioni di tre-sei punti di controllo situati sulla membrana tra le corrispondenti immagini pre-deformazione e post-deformazione. Il programma MATLAB calcola quindi la deformazione applicata alla membrana confrontando le posizioni dei punti di controllo corrispondenti tra le immagini pre-deformazione e quelle a deformazione completa.

Le posizioni vengono inoltre confrontate per individuare la deformazione residua tra le immagini pre-allenamento e quelle post-deformazione. I punti di controllo vengono utilizzati contemporaneamente per registrare le coppie di immagini, il che aiuterà a rilevare cellule danneggiate o in distacco. Successivamente, selezionare manualmente i nuclei mediante un programma MATLAB separato che calcola la deformazione nucleare per ciascun nucleo singolo.

Questo viene ottenuto confrontando le dimensioni nucleari tra le immagini fluorescenti pre deformazione e post deformazione corrispondenti oppure confrontando marcatori intranucleari per tenere conto di piccole variazioni nella deformazione applicata alla membrana tra diversi esperimenti. I risultati sono espressi come deformazione nucleare normalizzata. Questa è definita come il rapporto tra la deformazione nucleare indotta e la deformazione applicata alla membrana, calcolata per ciascun nucleo.

Gli script MATLAB sono disponibili su richiesta presso il laboratorio di Lambing. Come passaggio finale, ogni nucleo viene convalidato ed esclusi sono i dati provenienti da cellule che si staccano o subiscono danni durante l'applicazione della deformazione. I MEF che si espandono su due aree distinte della membrana in silicone sono stati acquisiti mediante microscopia a contrasto di fase e microscopia a fluorescenza prima, durante e dopo l'applicazione di una deformazione assiale del 20%UNI; qui mostrato è un esempio di esperimento riuscito con nuclei validi provenienti da cellule che sopravvivono all'applicazione della deformazione senza alcun danno o distacco.

Al contrario, le cellule mostrate qui si sono ritratte o sono risultate parzialmente staccate durante l'applicazione della deformazione e sono state escluse dall'analisi. La cellula sul lato sinistro mostra segni di danno al citoscheletro e collasso nucleare, mentre quella sul lato destro si stacca parzialmente e si ritrae durante l'applicazione della deformazione. Ciò può indicare una deformazione eccessiva.

Qui viene mostrata un'analisi della deformazione nucleare normalizzata in un insieme di diverse linee cellulari di cellule meth di topi privi di Laminina AC che esprimono in modo ectopico o un vettore vuoto o la laminina A di tipo selvaggio, in confronto a cellule di topi di tipo selvaggio appartenenti alla stessa nidiata. La perdita di espressione delle proteine dell'involucro nucleare, la Laminina AC, determina un aumento della deformazione nucleare normalizzata. Questo fenomeno indica una ridotta rigidità nucleare, che può essere in parte o completamente ripristinata mediante la re-introduzione della Laminina A di tipo selvaggio. Per preparare l'esperimento di manipolazione con microlancetta, incubare una piastra per colture cellulari da 35 millimetri con fondo in vetro e una bassa concentrazione di fibronectina per due ore a 37 gradi Celsius; al termine dell'incubazione, lavare la piastra due volte con HBSS e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita alla piastra.

Quindi i fibroblasti embrionali di topo vengono trattati con tripsina 0,05% e seminati nel mezzo di crescita su una piastra con fondo di vetro rivestito di fibronectina, utilizzando due millilitri di mezzo di crescita. Per ottenere singole cellule aderenti non confluenti, riporre le cellule nell'incubatrice durante la notte; per colorare le cellule, aggiungere al mezzo di crescita il colorante mitocondriale MIT tracker e un colorante nucleare marcato. Aggiungere questo mezzo di crescita alle cellule e procedere con l'incubazione.

Successivamente, lavare le cellule incubandole in soluzione salina tamponata di Hank per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere il mezzo di crescita privo di rosso fenolo con 25 millimolare. Aggiungere il pezzo di He alle cellule per l'acquisizione delle immagini.

Per l'esperimento con microlancetta, inserire una microlancetta precedentemente tirata in un micromanipolatore collegato a un microscopio invertito dotato di dispositivo digitale a accoppiamento di carica. Posizionare la telecamera e mettere a fuoco la microlancetta vicino a una singola cellula. Acquisire un'immagine della singola cellula senza che la microlancetta sia inserita nel citoscheletro.

In contrasto di fase, acquisire un'immagine fluorescente della colorazione con hooks 3 3, 3 4 2 e un'immagine fluorescente della colorazione mitocondriale con un obiettivo 60x su un microscopio invertito utilizzando il micromanipolatore; inserire con attenzione l'ago capillare nel citoplasma di una cellula a una distanza fissa dal periferia nucleare e acquisire un'immagine in contrasto di fase, un'immagine fluorescente della colorazione con hooks 3 3, 3 4, 2 e un'immagine fluorescente della colorazione mitocondriale. Spostare l'ago capillare verso la periferia cellulare di una distanza specifica a una velocità di un micrometro al secondo, utilizzando il micromanipolatore controllato dal computer, acquisendo automaticamente immagini ogni 10 secondi.

Mentre l'ago microscopico si sposta verso una distanza specifica rispetto alla periferia cellulare, il micromanipolatore deve essere controllato tramite computer per ottenere una micromanipolazione costante. Le procedure acquisiscono infine immagini dopo che l'ago microscopico è stato rimosso; le immagini del citoscheletro e delle caratteristiche fluorescenti del nucleo e del citoscheletro, acquisite prima, durante e dopo la manipolazione con l'ago microscopico, vengono analizzate per calcolare lo spostamento di piccole regioni intracellulari. In questa dimostrazione, viene utilizzato uno script MATLAB sviluppato su misura per l'analisi, ma sono disponibili diverse altre opzioni.

Lo script MATLAB è disponibile presso il laboratorio di ricerca su parto (lambing laboratory) su richiesta, per misurare lo spostamento generato dal microneedle. Il programma MATLAB utilizza un algoritmo di correlazione incrociata normalizzata per calcolare lo spostamento tra la posizione originale delle caratteristiche marcate con fluorescenza e la loro nuova posizione identificata. Gli spostamenti vengono quindi visualizzati come mappe vettoriali e memorizzati come valori numerici.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare le mappe risultanti dei vettori di spostamento per determinare gli spostamenti medi all'interno del citoscheletro o del nucleo mediante matlab. In primo luogo, selezionare tre o più punti all'interno del citoscheletro nel sito di applicazione della deformazione. Nella mappa dei vettori di spostamento, calcolare il valore numerico medio per determinare l'entità della deformazione del citoscheletro vicino al sito di applicazione generata durante l'applicazione del micropuntello.

Successivamente, selezionare tre o più punti all'interno del nucleo in prossimità del sito di applicazione della deformazione e calcolare il valore medio. Questo valore rappresenta l'entità della deformazione nucleare vicino al sito di applicazione dell'ago micrometrico. Utilizzando lo stesso metodo, determinare la deformazione nucleare e citoscheletrica in zone lontane dal sito di applicazione della deformazione, selezionando punti in queste regioni rispettive.

È stato eseguito un saggio di manipolazione con microlancetta per misurare la trasmissione della forza intracellulare. Qui sono mostrate immagini in contrasto di fase e immagini a fluorescenza di un fibroblasto marcato con colorante nucleare blu e colorante mitocondriale MIT tracker green. Una microlancetta è stata inserita nel citoscheletro a una distanza definita dal nucleo e successivamente spostata verso la periferia cellulare.

Lo spostamento mitocondriale è stato misurato prima, durante e dopo la deformazione del citoscheletro, e successivamente gli spostamenti sono stati rappresentati come vettori. Ogni vettore rappresenta lo spostamento calcolato come la differenza tra la posizione originale e la nuova posizione identificata. Le regioni con bassa intensità dell'immagine o con texture insufficiente sono state escluse dall'analisi.

Lo spostamento del citoscheletro e del nucleo è stato quindi quantificato in aree selezionate a distanze crescenti dal sito di applicazione della deformazione, sia nei fibroblasti di controllo che nei fibroblasti. Quando l'accoppiamento nucleo-citoscheletrico è alterato, nelle cellule in cui le forze di accoppiamento nucleo-citoscheletrico sono integre, queste vengono trasmesse attraverso l'intera cellula, provocando una deformazione indotta del nucleo e del citoscheletro che si attenua gradualmente allontanandosi dal sito di applicazione della deformazione. Al contrario, le cellule con accoppiamento nucleo-citoscheletrico disturbato mostrano uno spostamento localizzato nelle vicinanze del sito di applicazione e una deformazione indotta minima a distanza.

Un'applicazione comparabile della deformazione citoscheletrica nel sito di inserimento del microneedle è osservata sia nei fibroblasti di controllo sia nei fibroblasti con un'accoppiamento nucleo-citoscheletrico interrotto. Tuttavia, lo spostamento nucleare e citoscheletrico indotto in altre regioni era significativamente minore nei fibroblasti con accoppiamento nucleo-citoscheletrico alterato rispetto alle cellule di controllo. Pertanto, una riduzione dello spostamento citoscheletrico e nucleare rispetto al sito di applicazione della deformazione indica che la trasmissione forzata tra citoscheletro e nucleo era compromessa.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la meccanica nucleare e la trasmissione delle forze intracellulari tra il nucleo e il citoscheletro. Puoi utilizzare queste tecniche per studiare l'effetto di mutazioni nelle proteine dell'involucro nucleare o i cambiamenti nella composizione dell'involucro nucleare che si verificano durante lo sviluppo o nel cancro.