Name: Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Scopri saggi biofisici per misurare le proprietà meccaniche del nucleo cellulare e la trasmissione delle forze intracellulari nel citoscheletro. Queste tecniche permettono di studiare la rigidità nucleare in cellule viventi aderenti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e il Brigham and Women Hospital Cardiovascolare Award Leadership Group.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Substrato ceppo test Applicazione ceppo è stato utilizzato con successo da noi e altri gruppi per lo studio delle deformazioni indotte nucleare in cellule sottoposte a stress meccanici e di indagare l&#39;apporto di specifiche proteine ​​dell&#39;involucro nucleare alla rigidità nucleare. 4-8 Il vantaggio di questa tecnica è che le sonde proprietà meccaniche nuclei di vivere nel loro ambiente normale cellulare e del citoscheletro e che l&#39;applicazione dello sforzo substrato assomi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker FM Rosso e Verde FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 e M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Sale di Hank Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Fenolo libero, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato con filamento </td><td> Sutter strumento </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Lucido / lucido non armato fogli di silicone, 0.005 &quot; </td><td> Specialità Manufacturing Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato Dulbecco Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 millimetri dal fondo di vetro piatti cultura (FluoroDish) </td><td> Mondo Strumenti di precisione, INC </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 vuoto Grasso </td><td> Spi rifornimenti </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula interphase: strain supporto applicazione e manipolazione microago

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Nella maggior parte delle cellule eucariotiche, il nucleo è l&#39;organello più grande ed è tipicamente 2 a 10 volte più rigido del citoscheletro circostante, di conseguenza, le proprietà fisiche del nucleo contribuire in modo significativo il comportamento generale biomeccanico delle cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Per esempio, nella migrazione dei neutrofili ed invadere le cellule tumorali, rigidità nucleare può rappresentare un grosso ostacolo durante stravaso o il passaggio attraverso spazi ristretti all&#39;interno dei tessuti 1. D&#39;altra parte, il nucleo delle cellule nei tessuti meccanicamente attivi come muscolare richiede un adeguato sostegno strutturale resistere alle ripetute sollecitazioni meccaniche. È importante sottolineare che il nucleo è strettamente integrato nell&#39;architettura di cellulari, ma è fisicamente collegato al citoscheletro circostante, che è un requisito fondamentale per il movimento intracellulare e il posizionamento del nucleo, per esempio, in cellule polarizzate, nuclei sinaptica a giunzioni neuromuscolari, o nella migrazione delle cellule. 2 Non sorprendentemente, mutazioni nelle proteine ​​dell&#39;involucro nucleare, come lamine e nesprins, che svolgono un ruolo critico nel determinare la rigidità nucleare e nucleo-citoscheletro accoppiamento, hanno dimostrato di recente per portare a una serie di malattie umane, tra cui Emery- Dreifuss distrofia muscolare, distrofia dei cingoli distrofia muscolare e cardiomiopatia dilatativa. 3 Per studiare la funzione di biofisica delle diverse proteine ​​dell&#39;involucro nucleare e l&#39;effetto di mutazioni specifiche, abbiamo sviluppato metodi sperimentali per studiare le proprietà fisiche del nucleo in camere singole, le cellule viventi sottoposti a globale o localizzata perturbazione meccanica. Misura delle deformazioni indotte nucleari in risposta alla domanda di supporto proprio applicata ceppo rendimenti importanti informazioni sulla deformabilità del nucleo e permette di confronto quantitativo tra le diverse mutazioni o linee cellulari deficienti per specifiche proteine ​​dell&#39;involucro nucleare. Localizzata applicazione dello sforzo del citoscheletro con un microago viene utilizzato per integrare il dosaggio e può fornire ulteriori informazioni sulla trasmissione della forza intracellulare tra il nucleo e il citoscheletro. Studiare meccanica nucleare nelle cellule viventi conserva intatte l&#39;architettura normale intracellulare ed evita artefatti potenziali che possono sorgere quando si lavora con nuclei isolati. Inoltre, lo sforzo di applicazione substrato presenta un buon modello per lo stress fisiologico sperimentato da cellule muscolari o di altri tessuti (per esempio, cellule muscolari lisce vascolari esposti al ceppo nave). Infine, mentre questi strumenti sono stati sviluppati principalmente per studiare la meccanica nucleare, possono anche essere applicato per studiare la funzione delle proteine ​​del citoscheletro e di segnalazione meccanotrasduzione.

Vi presentiamo due indipendenti, microscopio a base di strumenti per misurare le deformazioni indotte nucleare e del citoscheletro in camere singole, cellule viventi aderenti in risposta alla applicazione dello sforzo globale o localizzato. Queste tecniche vengono utilizzate per determinare la rigidità nucleare (cioè, deformabilità) e di sondare la trasmissione intracellulare vigore tra il nucleo e il citoscheletro.

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

Nella maggior parte delle cellule eucariotiche, il nucleo è l'organello più grande ed è tipicamente da 2 a 10 volte più rigido del citoscheletro circostante; conseguentemente, il ...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è misurare le proprietà meccaniche dell'interfaccia tra il nucleo cellulare e la sua connessione fisica con il citoscheletro circostante. Questo viene ottenuto applicando una deformazione meccanica a cellule seminate su una membrana di silicone trasparente e acquisendo immagini delle deformazioni nucleari indotte. Deformazioni nucleari maggiori corrispondono a una rigidità nucleare ridotta, poiché variazioni nell'accoppiamento nucleo-citoscheletrico possono influenzare anche le deformazioni nucleari indotte.La trasmissione delle forze intracellulari tra citoscheletro e nucleo viene analizzata direttamente applicando una deformazione localizzata al citoscheletro. Successivamente, viene effettuata un'immagine dello spostamento delle strutture nucleari NU e del citoscheletro marcate con fluorescenza. I risultati ottenuti mostrano la rigidità dei nuclei cellulari in relazione al citoscheletro circostante.In base agli esperimenti di deformazione del substrato, il saggio di manipolazione dei microaghi rivela che l'alterazione dell'accoppiamento nucleo-citoscheletrico provoca difetti nella trasmissione delle forze intracellulari. Il principale

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici.

Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Descritti sono i protocolli per quantificare le interazioni meccaniche tra cellule aderenti e substrati microstrutturati. Queste interazioni sono strettamente legate a comportamenti cellulari essenziali tra cui la migrazione, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi. I protocolli presentano un software di analisi delle immagini open source chiamato MechProfiler, che consente di determinare le forze coinvolte per ogni micropalo.

Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

In questo protocollo, descriviamo un metodo micropipetta per applicare direttamente una forza controllata al nucleo in una cellula vivente. Questo test permette di interrogatorio di proprietà meccaniche nucleari nella cellula viva, aderente.

Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

Utilizzando un dispositivo progettato in precedenza per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti, questo documento descrive una geometria del substrato ridisegnata e un apparato personalizzato per l'imaging a cella singola ad alta risoluzione delle cellule tese con un obiettivo di immersione in olio 100x.

Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Presentiamo un metodo di iniezione cellulare tramite tecnologia waterjet senza ago accoppiato con una sequela di indagini post-parto in termini di vitalità cellulare, proliferazione ed misure di elasticità.

Iniezione di cellule stroma derivate dal tessuto adiposo suino tramite tecnologia Waterjet

Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.

Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

Presentato qui è un metodo per fenotipizzare meccanicamente singole cellule utilizzando una piattaforma microfluidica basata sull'elettronica chiamata mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Questa piattaforma mantiene un throughput moderato di 1-10 cellule / s misurando sia le proprietà biofisiche elastiche che viscose delle cellule.

Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche

L'esplorazione del comportamento cellulare sotto stress meccanico è fondamentale per i progressi della meccanica cellulare e della meccanobiologia. Introduciamo la tecnica di aspirazione a fluorescenza con micropipette (fMPA), un nuovo metodo che combina la stimolazione meccanica controllata con l'analisi completa della segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Questa tecnica indaga nuovi studi approfonditi sulla meccanobiologia delle cellule vive.

Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Scopri saggi biofisici per misurare le proprietà meccaniche del nucleo cellulare e la trasmissione delle forze intracellulari nel citoscheletro. Queste tecniche permettono di studiare la rigidità nucleare in cellule viventi aderenti.

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago (Video) | JoVE Journal

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

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