Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di misurare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula di interfaccia e la sua connessione fisica con il citoscheletro circostante. Ciò si ottiene applicando una deformazione meccanica alle cellule placcate su una membrana di silicone trasparente e visualizzando le deformazioni nucleari indotte. L'aumento delle deformazioni nucleari corrisponde a una diminuzione della rigidità nucleare poiché anche i cambiamenti nell'accoppiamento nucleo-scheletrico possono influenzare le deformazioni nucleari indotte.

La trasmissione della forza intracellulare tra il citoscheletro e il nucleo viene sondata direttamente applicando un ceppo localizzato al citoscheletro. Viene quindi eseguito l'imaging dello spostamento delle strutture nucleari e citoscheletriche di NU marcate in fluorescenza. Si ottengono risultati che mostrano la rigidità dei nuclei cellulari rispetto al citoscheletro circostante.

Sulla base degli esperimenti sul ceppo del substrato, il saggio di manipolazione con microaghi rivela che l'interruzione dell'accoppiamento nucleocitoscheletrico causa difetti nella trasmissione della forza intracellulare. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti, come l'aspirazione con micropipette di nuclei isolati, è che consentono di misurare la meccanica nucleare e le cellule viventi intatte senza disturbare la normale architettura cellulare. Questi metodi possono fornire informazioni su come i cambiamenti nella composizione dell'involucro nucleare possono influenzare le proprietà meccaniche del nucleo.

Possono anche essere applicati per studiare il ruolo della meccanica nucleare nel contesto di malattie come le neuropatie LA o il cancro. Ogni piatto di ceppo è costituito da un piatto di plastica senza fondo realizzato su misura con un diametro di tre pollici e un O-ring di plastica per contenere una membrana di silicone, che funge da substrato di coltura cellulare. Per la preparazione del piatto di filtraggio, bloccare un pezzo di membrana di silicone di quattro pollici per quattro pollici tra un O-ring e il piatto, tagliare accuratamente la membrana in eccesso, sciacquare il piatto di filtraggio con acqua deionizzata, quindi sterilizzare in autoclave il piatto prima di rivestire la membrana di silicone con molecole di matrice extracellulare, segnare un punto di riferimento all'esterno della membrana in basso al centro.

Questo punto di riferimento aiuterà a identificare le stesse celle durante gli esperimenti di deformazione per l'applicazione di deformazione uniassiale. Due strisce parallele di scotch vengono applicate attorno al punto di riferimento per limitare la formazione della membrana in una dimensione. Per fornire un fissaggio ottimale delle cellule, rivestire le membrane di silicone con tre microgrammi per millilitro di fibronectina o qualsiasi proteina della matrice extracellulare adatta.

Copri il piatto di varietà con un piatto di polistirene capovolto da 10 centimetri e incubalo per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Sciacquare la membrana una volta con PBS per rimuovere le proteine in eccesso. Riempite il piatto con 10 millilitri di accrescimento, medio e mettete da parte.

Una volta che la capsula della membrana in silicone rivestita è stata preparata, la tripsina osserva le cellule con lo 0,05% di tryin e semina una cellula aderente sulla capsula. In mezzo di crescita. Questa procedura è dimostrata con l'embrionale di topo.

I fibroblasti o mes incubano le cellule per 24-48 ore in condizioni di coltura normali. Un microscopio invertito attrezzato per esperimenti di deformazione del substrato include un dispositivo di deformazione costituito da una piastra di base che si adatta al tavolino del microscopio. La piastra contiene un platino cilindrico centrale, che serve ad applicare una tensione alla sezione centrale della membrana in silicone.

Il dispositivo ha anche una piastra mobile che tiene il piatto di tensione e può scorrere su e giù su quattro perni di guida, nonché un peso di cinque libbre per applicare un carico. Per visualizzare i nuclei, incubare le cellule nel piatto del ceppo con un microgrammo per millilitro di colorante uncinato per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno e sostituirlo con 15 millilitri di terreno di crescita libero rosso fenolo con 25 millimolari di heis.

Quindi avvitare la piastra nel portapiatto e applicare con cura il grasso sul perimetro del fondo della membrana in silicone per garantire lo scorrimento della membrana lungo il platino centrale. Assicurati di mantenere libera la sezione centrale della membrana. Posizionare la piastra di base sulla piastra del tavolino del microscopio e montare con cura il portapiatti sulla piastra di base.

Assicurarsi che nella posizione di riposo iniziale, la membrana in silicone del piatto di tensione poggi liberamente sulla piastra centrale. Quindi, concentrati sul fondo della membrana in silicone e trova il punto di riferimento nero centrale. Il punto servirà come punto di partenza per tutte le acquisizioni di immagini e aiuterà a localizzare le stesse cellule durante e dopo l'allungamento.

In questa immagine, il punto centrale riempie l'intero campo visivo. Partendo dal bordo del punto, regola la messa a fuoco per visualizzare le cellule e la parte superiore della membrana in silicone. Localizzare cellule ben distribuite con nuclei posizionati centralmente.

Acquisisci un'immagine di contrasto del viso, che dovrebbe concentrarsi sul contorno della cellula e sulla membrana di silicone. Quindi acquisire un'immagine a fluorescenza della colorazione dell'uncino nucleare nu, che dovrebbe concentrarsi sul piano centrale del nucleo. Dopo aver acquisito le immagini da cinque a 15 cellule, tornare al punto centrale.

Applicare lentamente il peso sul piatto di tensione ottenendo un'applicazione uniforme della tensione. Al centro del piatto. La massima deformazione applicata del substrato è limitata dai distanziatori in nylon posizionati sui perni di allineamento verticale dopo l'applicazione della deformazione, concentrandosi sul fondo della membrana in silicone e individuando nuovamente il punto di riferimento, partendo dal punto.

Riposizionare le stesse cellule e, di nuovo, acquisire un'immagine di contrasto di fase, fine della fluorescenza di ciascuna cellula nel nucleo sotto piena tensione, cercando di corrispondere strettamente ai piani focali delle immagini iniziali. Questo processo non deve superare i 10 minuti per evitare il rimodellamento attivo e l'adattamento della cellula allo strano substrato. Dopo aver acquisito tutte le immagini corrispondenti, riportare il tavolino del microscopio al punto di partenza.

Rimuovere con cautela il peso dalla piastra portapiatti e, se necessario, lasciare che la membrana in silicone si rilassi. Spingere delicatamente verso l'alto il piatto filtrante fino a portarlo nella posizione iniziale. Quindi acquisire il contrasto di fase e la fluorescenza.

Le immagini delle cellule post-deformazione, proprio come descritto per le immagini del deformazione, le immagini delle cellule e i nuclei marcati in fluorescenza prima, durante e dopo l'applicazione del deformazione vengono analizzati per calcolare il ceppo nucleare normalizzato. In questa dimostrazione, per l'analisi viene utilizzato uno script MATLAB scritto su misura, ma sono disponibili diverse opzioni alternative per calcolare manualmente la deformazione del substrato applicata che corrisponde alle posizioni di tre o sei punti di controllo situati sulla membrana tra le corrispondenti immagini pre full e post deformazione. Il programma MATLAB calcola quindi la deformazione della membrana applicata confrontando le posizioni dei punti di controllo corrispondenti tra le immagini di pre-treno e di deformazione completa.

Le posizioni vengono anche confrontate per la deformazione residua tra le immagini pre-treno e post-deformazione. I punti di controllo vengono utilizzati contemporaneamente per registrare le coppie di immagini, il che aiuterà a rilevare le cellule danneggiate o staccate. Successivamente, seleziona manualmente i nuclei utilizzando un programma MATLAB separato che calcola la deformazione nucleare per ogni singolo nucleo.

Ciò si ottiene confrontando la dimensione nucleare tra le corrispondenti immagini fluorescenti pre full e post strain o abbinando i marcatori intranucleari per tenere conto di piccole variazioni nella deformazione di membrana applicata tra diversi esperimenti. I risultati sono espressi come deformazione nucleare normalizzata. Questo è definito come il rapporto tra la deformazione nucleare indotta e la deformazione di membrana applicata calcolata per ciascun nucleo.

Gli script MATLAB sono disponibili su richiesta presso il laboratorio di parto. Come passaggio finale, ogni nucleo viene convalidato e vengono escluse le misurazioni delle cellule che si staccano o si danneggiano durante l'applicazione del deformazione. I MEF distribuiti su due aree distinte sulla membrana di silicone sono stati ripresi con contrasto di fase e microscopia a fluorescenza prima, durante e dopo l'applicazione di una deformazione assiale UNI del 20% mostrata qui è un esempio di un esperimento riuscito con nuclei validi da cellule che sopravvivono all'applicazione della deformazione senza alcun danno o distacco.

Al contrario, le cellule mostrate qui si sono retratte o si sono parzialmente staccate durante l'applicazione del ceppo e sono escluse dall'analisi. La cellula sul lato sinistro mostra segni di danno citoscheletrico e collasso nucleare, mentre la cellula sul lato destro si stacca parzialmente e si ritrae durante l'applicazione del deformazione. Questo può essere un'indicazione di uno sforzo eccessivo.

Qui, un'analisi della deformazione nucleare normalizzata in un pannello di diverse linee cellulari di metanfetamine di topi carenti di Lamina AC mostra che la cellula esprime ectopicamente un vettore vuoto o una lamina A di tipo selvatico rispetto ai miti dei compagni di cucciolata di tipo selvatico, perdita di espressione delle proteine dell'involucro nucleare. La lamina AC provoca un aumento della deformazione nucleare normalizzata. Ciò è indicativo di una diminuzione della rigidità nucleare, che può essere parzialmente o completamente ripristinata con la reintroduzione della lamina di tipo selvatico A.To prepararsi per l'esperimento di manipolazione con microaghi, incubare una piastra di coltura cellulare con fondo di vetro da 35 millimetri con una bassa concentrazione di fibronectina per due ore a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione, lavare la piastra due volte con HBSS e aggiungere due millilitri di terreno di crescita alla capsula.

Quindi i fibroblasti embrionali di topo vengono tripizzati con lo 0,05% di tripsina e seminati in terreno di crescita sul piatto inferiore di vetro rivestito di fibronectina in due millilitri di terreno di crescita. Per ottenere singole cellule aderenti A non cofluenti, riposizionare le cellule nell'incubatore durante la notte per colorare le cellule, aggiungere la colorazione mitocondriale MIT tracker e la colorazione nucleare agganciata al mezzo di crescita. Aggiungere questo terreno di coltura alle cellule e proseguire con l'incubazione.

Quindi, lavare le cellule incubandole nella soluzione salina tamponata di matassa per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere il terreno di crescita libero rosso fenolo con 25 millimolari. Ha pezzo alle cellule per l'imaging.

Per l'esperimento con microago, inserire un microago precedentemente estratto in un micromanipolatore accoppiato a un microscopio invertito con un dispositivo ad accoppiamento di carica digitale. Fotocamera e mettere a fuoco il microago vicino a una singola cellula. Acquisire un'immagine della singola cellula senza il microago inserito nel citoscheletro.

In contrasto di fase, un'immagine fluorescente della colorazione degli uncini 3, 3, 4, 2 e un'immagine fluorescente della colorazione mitocondriale con un obiettivo 60 x su un microscopio invertito utilizzando il micro manipolatore, inserire con cura il microago nel citoplasma di una cellula a una distanza fissa dalla periferia nucleare e scattare un'immagine a contrasto di fase, un'immagine fluorescente dei ganci. 3, 3, 3, 4, 2 coloranti e un'immagine fluorescente della colorazione mitocondriale. Sposta il microago di una distanza specifica verso la periferia della cellula a un micrometro al secondo, utilizzando il micromanipolatore controllato dal computer e acquisendo automaticamente le immagini ogni 10 secondi.

Poiché il microago si muove a una distanza specifica verso la periferia della cellula, il micromanipolatore deve essere controllato tramite un computer per ottenere una micro-manipolazione coerente. Le procedure infine acquisiscono le immagini dopo che il microago è stato rimosso dal citoscheletro Le immagini delle caratteristiche marcate in fluorescenza del nucleo e del citoscheletro acquisite prima, durante e dopo la manipolazione del microago vengono analizzate per calcolare lo spostamento di piccole regioni intracellulari. In questa dimostrazione, per l'analisi viene utilizzato uno script MATLAB scritto su misura, ma sono disponibili diverse altre opzioni.

Lo script MATLAB è disponibile presso il laboratorio di parto su richiesta per misurare lo spostamento generato dal microago. Il programma MATLAB utilizza un algoritmo di correlazione incrociata normalizzata per calcolare lo spostamento tra la posizione originale delle caratteristiche marcate in fluorescenza e la loro posizione appena identificata. Gli spostamenti vengono quindi visualizzati come mappe vettoriali e memorizzati come valori numerici.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare le mappe vettoriali di spostamento risultanti per determinare gli spostamenti medi all'interno del citoscheletro o del nucleo con matlab. Innanzitutto, selezionare tre o più punti all'interno del citoscheletro nel sito di applicazione del ceppo. Nella mappa del vettore di spostamento, prendere il valore numerico medio per determinare la quantità di deformazione citoscheletrica vicino al sito di applicazione che è stata generata durante l'applicazione del microago.

Quindi, selezionare tre o più punti all'interno del nucleo vicino al sito di applicazione della deformazione e prendere il valore medio. Questo valore rappresenta la quantità di deformazione nucleare vicino al sito di applicazione del microago. Utilizzando lo stesso metodo, determinare la deformazione nucleare e citoscheletrica lontano dal sito di applicazione del ceppo da punti selezionati in queste rispettive regioni.

È stato eseguito un test di manipolazione con microaghi per misurare la trasmissione della forza intracellulare. Qui sono mostrate immagini a contrasto di fase e immagini a fluorescenza di un fibroblasto marcato con una colorazione nucleare blu e una colorazione mitocondriale verde del MIT tracker. Un microago è stato inserito nel citoscheletro a una distanza definita dal nucleo e successivamente spostato verso la periferia della cellula.

spostamento mitocondriale si protrae prima, durante e dopo la deformazione citoscheletrica, e quindi lo spostamento è stato tracciato come vettori. Ogni vettore rappresenta lo spostamento calcolato come spostamento tra la posizione originale e la posizione appena identificata. Le regioni con bassa intensità dell'immagine o consistenza insufficiente sono state escluse dall'analisi.

Lo spostamento citoscheletrico e nucleare è stato quindi quantificato in aree selezionate a distanze crescenti dal sito di applicazione del ceppo sia per i fibroblasti di controllo che per i fibroblasti. Con un nucleo interrotto, l'accoppiamento citoscheletrico nelle cellule con nucleo intatto, le forze di accoppiamento citoscheletrico vengono trasmesse attraverso l'intera cellula, con conseguente deformazione nucleare e citoscheletrica indotta che si dissipa lentamente lontano dal sito di applicazione del ceppo. Al contrario, le cellule con accoppiamento nucleocitoscheletrico disturbato mostrano uno spostamento localizzato vicino al sito di applicazione e solo una piccola deformazione indotta più lontano.

L'applicazione di un ceppo citoscheletrico comparabile nel sito di inserimento del microago è stata osservata sia per i fibroblasti di controllo che per i fibroblasti con un accoppiamento nucleocitoscheletrico interrotto. Tuttavia, lo spostamento nucleare e citoscheletrico indotto in altre regioni era significativamente più piccolo nei fibroblasti con accoppiamento nucleocitoscheletro interrotto rispetto alle cellule di controllo. Pertanto, una diminuzione dello spostamento del citoscheletro e del nucleo lontano dal sito di applicazione del ceppo indica che la trasmissione forzata tra il citoscheletro e il nucleo è stata disturbata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la meccanica nucleare e la trasmissione della forza intracellulare tra il nucleo e il citoscheletro. È possibile utilizzare queste tecniche per studiare l'effetto delle mutazioni nelle proteine dell'involucro nucleare o dei cambiamenti nella composizione dell'involucro nucleare che si sono verificati durante lo sviluppo o nel cancro.