JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:54 min. • July 8th, 2025
Prelevare una micropiastra contenente il fungo Candida tropicalis.
Le cellule secernono Sap2, un enzima proteolitico che scinde una glicoproteina transmembrana chiamata Msb2, rimuovendo il suo dominio inibitorio.
Questo induce il fungo ad aderire al fondo e a crescere in una microcolonia di lieviti e forme filamentose. Le cellule secernono componenti solubili e biopolimeri, avviando la formazione di biofilm.
Aggiungere un campione di siero contenente anticorpi specifici per Sap2 a pozzetti selezionati e incubare al buio.
Gli anticorpi si legano a Sap2 e ne neutralizzano l'attività, impedendo la vitalità cellulare e la maturazione del biofilm.
Nei pozzetti non trattati, il biofilm matura in una fitta rete di cellule e matrice extracellulare.
Aspirare il liquido, lavare il biofilm e asciugare la piastra all'aria. Aggiungere un substrato cromogenico e incubare al buio.
Le cellule vitali, utilizzando ossidoreduttasi legate alla membrana, riducono il substrato a un prodotto colorato.
Trasferire il surnatante colorato e leggere l'assorbanza.
Una minore assorbanza nei pozzetti trattati con siero indica l'inibizione del biofilm mediata da anticorpi.
Preparare diluizioni seriali di campioni di siero inattivati termicamente in RPMI1640 sterile in mezzo MOPS. Aggiungere 100 microlitri della diluizione del siero selezionata a ciascun pozzetto della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Nella colonna 10, aggiungere solo il terreno RPMI1640-MOPS per il controllo positivo del solo fungo. Aggiungere una diluizione da 1 a 50 di siero a tutti i pozzetti della colonna 11 per fungere da controllo negativo senza funghi più siero. Dopo aver coperto la piastra con un coperchio e un foglio di alluminio, incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, dopo aver aspirato accuratamente il siero utilizzando una pipetta multicanale, picchiettare delicatamente la piastra capovolta per rimuovere eventuali residui di siero. Ripetere il lavaggio PBS tre volte e asciugare la piastra all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno di una cabina di sicurezza biologica per asciugare il PBS in eccesso.
Quindi, sciogliere 25 milligrammi di XTT in 50 millilitri di lattato di Ringer sterilizzato con filtro. Aliquotare 10 millilitri in tubi separati. Coprilo con un foglio di alluminio e conservalo a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, sciogliere 8,6 milligrammi di menadione in 5 millilitri di acetone e, dopo aver distribuito 50 microlitri in 100 microprovette separate, conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius.
Prendi 10 millilitri di XTT e aggiungi 1 microlitro di menadione per ottenere una soluzione di lavoro da 1 micromolare. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di menadione XTT per pozzetto della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Successivamente, dopo aver coperto la piastra con un coperchio e un foglio di alluminio, incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius al buio. Infine, trasferire 80 microlitri del surnatante colorato da ciascun pozzetto in una piastra fresca a 96 pozzetti e leggere la piastra a 490 nanometri.