Una tecnica di immunofluorescenza a doppia marcatura per visualizzare le proteine dell'ospite e del patogeno in una cellula infetta

Inizia con cellule epiteliali fisse e permeabilizzate infettate da un parassita patogeno.

Aggiungere un buffer di blocco per impedire il legame di anticorpi non specifici.

Sovrapposizione con anticorpi primari policlonali di topo, che interagiscono specificamente con le proteine del parassita.

Aggiungere anticorpi secondari marcati con fluorofori rossi lontani che interagiscono con gli anticorpi primari legati alle proteine parassite.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati. Blocco con anticorpi anti-topo che si legano agli anticorpi primari, riducendo al minimo la cross-reattività durante la marcatura della proteina ospite.

Aggiungere anticorpi primari monoclonali di topo che hanno come bersaglio le ribonucleoproteine dell'ospite all'interno delle cellule epiteliali.

Sovrapposizione con un mix di anticorpi secondari marcati con fluoroforo verde e falloidina coniugata con fluoroforo rosso, facilitando la marcatura rispettivamente degli anticorpi primari legati alla proteina ospite e dell'actina.

Lavare con un tampone. Montare utilizzando un mezzo contenente coloranti di DNA, conferendo una colorazione blu al nucleo ospite, al nucleo del parassita e al cinetoplasto.

Analizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale. La tecnica di immunofluorescenza a doppia marcatura mostra le proteine dell'ospite verdi e le proteine parassite rosse, consentendo la loro precisa localizzazione subcellulare.

Aggiungere le cellule LLC-MK2 in piastre a 24 pozzetti contenenti vetrini coprioggetti arrotondati sterilizzati con raggi UV e lasciarle riposare per 16 ore. Quindi, per infettare le cellule, aggiungere un surnatante contenente T. cruzi a ciascun pozzetto e incubare per sei ore. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetti contenenti le cellule infette e non infette 5 volte con PBS.

Quindi, fissare le cellule con paraformaldeide al 2% e PBS. Dopo 10 minuti, lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuna con PBS, quindi permeabilizzare i vetrini coprioggetti con detergente non ionico per 10 minuti.

Dopo tre lavaggi PBS di 5 minuti, incubare i vetrini coprioggetti in soluzione bloccante per 30 minuti, seguiti da un'altra incubazione di 30 minuti con un anticorpo monoclonale o policlonale di topo. Dopo i lavaggi, incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti con anticorpi secondari in soluzione bloccante e falloidina per colorare i filamenti di actina nella cellula ospite.

Quindi, lavare nuovamente i vetrini coprioggetti con PBS tre volte prima di applicare una piccola quantità di reagente di montaggio anti-sbiadimento con terreno DAPI sulla superficie del vetrino. Usando una pinza, inclinare delicatamente il vetrino coprioggetti nel mezzo per evitare la formazione di bolle.

Per la doppia marcatura, dopo aver incubato i vetrini coprioggetto e la soluzione bloccante come dimostrato in precedenza, incubarli nell'anticorpo policlonale di topo per 30 minuti. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con PBS prima di incubarli con l'anticorpo secondario per 30 minuti.

Quindi, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una seconda fase di blocco con AffiniPure rabbit anti-mouse IgG diluito in soluzione bloccante. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente i vetrini coprioggetti con PBS prima di incubarli con l'anticorpo monoclonale di topo per altri 30 minuti.

Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, incubare i vetrini coprioggetti con anticorpo IgG2b di capra anti-topo e falloidina. Quindi, dopo tre lavaggi PBS, applicare il reagente di montaggio anti-sbiadimento come dimostrato in precedenza.