JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:03 min • July 8th, 2025
Prelevare una colonna per cromatografia di affinità contenente perle di agarosio coniugate alla proteina A, una proteina legante gli anticorpi.
Aggiungere un tampone legante con un pH neutro per equilibrare la colonna.
Caricare il surnatante di coltura da una coltura cellulare produttrice di anticorpi, contenente anticorpi monoclonali e proteine cellulari contaminanti.
Il pH neutro facilita il legame della proteina A con la regione Fc degli anticorpi mentre i contaminanti fluiscono attraverso.
Misurare l'assorbanza UV del flusso per creare un cromatogramma. Un'elevata assorbanza durante il caricamento del campione indica proteine non legate nel flusso.
Lavare la colonna con il tampone legante per rimuovere i contaminanti non specificamente legati.
Aggiungere un tampone di eluizione con un pH basso per interrompere l'interazione proteina A-anticorpo. Raccogliere gli anticorpi eluiti monitorando il picco di assorbanza.
Neutralizzare il pH per prevenire la degradazione degli anticorpi e trasferirlo in un filtro centrifugo.
Centrifugare per concentrare gli anticorpi e risospendere in un tampone per i saggi a valle.
Dopo aver preparato i buffer e inizializzato il sistema FPLC in base al protocollo di testo, utilizzare l'editor dei metodi per impostare i passaggi di esecuzione come indicato di seguito. Equilibrare il sistema con cinque volumi di colonne o CV di buffer di legatura.
Caricare il campione sulla colonna e raccogliere il flusso del campione, quindi utilizzare cinque CV di tampone legante per lavare il sistema. Utilizzare cinque CV di tampone di eluizione per eluire la colonna tramite frazionamento isocratico. e raccogliere i campioni di anticorpi purificati come frazioni utilizzando il collettore di frazioni.
Infine, equilibrare il sistema con cinque CV di tampone legante e raccogliere il flusso in un contenitore per rifiuti. Una volta completata l'impostazione del metodo, specificare il volume del fluido condizionato da applicare alla colonna e salvare il metodo.
Quindi, immergere il tubo della pompa del campione nel recipiente contenente il mezzo condizionato. Quindi, preparare un contenitore separato per raccogliere il flusso del campione attraverso il tubo di uscita specificato. Inserire le provette di raccolta nel collettore di frazioni e aggiungere un tampone di neutralizzazione a ciascuna provetta di raccolta. Nel modulo di controllo del sistema del software, aprire il metodo da utilizzare. Quindi fare clic su Avvia per avviare l'esecuzione.
Al termine della purificazione e del modulo di valutazione, controllare il cromatogramma risultante. Combinare tutte le frazioni contenenti proteine in una provetta, quindi utilizzare il PBS e un dispositivo di filtro centrifugo con un cutoff di 30 kilodalton per concentrare il campione ed effettuare lo scambio di tamponi. Infine, utilizzare il test BCA per misurare la concentrazione di anticorpi secondo le istruzioni del produttore.