JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:18 min. • July 8th, 2025
Prendiamo una sezione cerebrale murina costituita dal giro dentato dell'ippocampo, un sito per la neurogenesi composto da progenitori neuronali in fasi di differenziazione distinte.
Trasferire la sezione in una soluzione che blocca la permeabilizzazione. Le molecole detergenti nella soluzione permeabilizzano le cellule, mentre le proteine bloccano i siti di legame non specifici.
Aggiungere un cocktail di anticorpi primari mirati a specifici marcatori di neurogenesi, una proteina associata ai microtubuli e una proteina del filamento intermedio.
Rimuovere gli anticorpi non legati. Introdurre diversi anticorpi secondari marcati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.
Aggiungere proteine sieriche dallo stesso ospite di uno degli anticorpi primari, saturando i paratopi sugli anticorpi secondari.
Introdurre frammenti Fab monovalenti che saturano gli epitopi delle proteine del siero, impedendo il legame aspecifico.
Aggiungere un secondo anticorpo primario allevato dallo stesso ospite, legandosi a un'altra proteina del filamento intermedio.
Introdurre anticorpi secondari marcati con fluorofori che hanno come bersaglio il secondo anticorpo primario.
Utilizzando la microscopia a fluorescenza, identificare i sottotipi progenitori neuronali che esprimono combinazioni di marcatori uniche.
Inizia trasferendo le sezioni dalla soluzione antigelo a TBS con l'aiuto di una spazzola fine. Risciacquare accuratamente le sezioni, iniziando con un lavaggio notturno a 4 gradi Celsius, seguito da cinque lavaggi di 10 minuti a temperatura ambiente. Tutte queste incubazioni devono essere eseguite con un'agitazione delicata e continua.
Se uno degli antigeni di interesse è un analogo della timidina, a questo punto deve essere attuata una fase di denaturazione dell'acido cloridrico, seguita da una fase di neutralizzazione in tampone borato. Procedere con la permeabilizzazione e il blocco dei siti di legame degli anticorpi aspecifici in TBS-plus. Lasciare che l'incubazione proceda per 1 ora a temperatura ambiente.
Quindi, incubare il primo anticorpo primario diluito in TBS-plus durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte in TBS e una volta in TBS-T. Lascia andare ogni bagno per 10 minuti. Quindi, incubare nel primo anticorpo secondario coniugato con fluorocromo per tre ore a temperatura ambiente. D'ora in poi, proteggere le sezioni dall'esposizione alla luce.
Dopo un'altra serie di lavaggi, trasferire le sezioni in una soluzione di siero al 10% di specie ospite da cui sono stati prodotti i due anticorpi primari. Incubare le sezioni in questa soluzione per tre ore per saturare i paratopi aperti sul primo anticorpo secondario. Successivamente, risciacquare tre volte in TBS e una volta in TBS-T per rimuovere il siero.
Quindi, preparare una soluzione di TBS-plus con 50 microgrammi per millilitro di frammenti di Fab monovalenti non coniugati diretti contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Questo copre gli epitopi che potrebbero altrimenti essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario. Trasferire le sezioni in questa soluzione e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sciacquare le sezioni almeno tre volte in TBS e una volta in TBS-T. Durante i trasferimenti, tamponare gli inserti in rete contenenti le sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere i residui di Fab. Ora, incubare le sezioni nel secondo anticorpo primario durante la notte a 4 gradi Celsius.
Dopo un'altra serie di lavaggi, applicare il secondo anticorpo secondario per tre ore a temperatura ambiente. Infine, lavare le sezioni tre volte in TBS e procedere con il montaggio delle sezioni nella gelatina. Asciugare all'aria i vetrini e i vetrini coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.