Una tecnica di immunomarcatura per visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine

Inizia lavando una sezione fissa del cuore in un tampone di cacodilato di sodio che stabilizza la struttura del tessuto. Immergere la sezione nel tetraossido di osmio per colorare i lipidi di membrana.

Trattare con acetato di sodio per mantenere un pH ottimale per la colorazione.

Aggiungere l'acetato di uranile alle biomolecole coloranti, fornendo un migliore contrasto durante la microscopia.

Disidratare il tessuto in concentrazioni crescenti di etanolo seguito da acetone.

Incorporare il tessuto in una resina, ottenere sezioni ultrasottili e trasferirle su una griglia di microscopia.

Introdurre il meta-periodato di sodio per rimuovere il tetraossido di osmio, smascherando la proteina cellulare.

Il composto ossida anche la glicoproteina, creando gruppi aldeidici reattivi, che vengono neutralizzati dal trattamento con glicina.

Introdurre un tampone bloccante, impedendo il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi primari specifici per la proteina bersaglio seguiti da anticorpi secondari biotinilati.

Aggiungi punti quantici coniugati con streptavidina che si legano alla biotina.

Al microscopio elettronico, le regioni marcate con punti quantici mostrano un contrasto più elevato, favorendo una precisa localizzazione subcellulare della proteina bersaglio.

Dopo 24 ore di fissazione, lavare il tessuto in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare due volte per 20 minuti. Rimuovere il tessuto dal tampone di cacodilato di sodio e immergerlo in una soluzione di tetrossido di osmio al 2% per 4 ore a temperatura ambiente.

Dopo l'osmicazione, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di sodio al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di uranile al 2% per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo la colorazione con acetato di uranile, disidratare il tessuto in sequenza attraverso gli alcoli graduati e l'acetone.

Incorporare il tessuto disidratato in resina epossidica a bassa viscosità come descritto nel manoscritto. Metti il tessuto in resina fresca in microstampi da 8 millimetri, stampi e polimerizza il tessuto incorporato a 70 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver trovato l'area di interesse utilizzando un coltello a 45 gradi, produci sezioni ultrasottili in oro pallido. Posiziona queste sezioni ultrasottili sul lato opaco di una griglia di rame da 200 maglie.

Iniziare la colorazione smascherando l'antigene mettendo 20 microlitri di soluzione mordenzante metaperiodato di sodio su un film di paraffina pulito. Posizionare la griglia essiccata con sezioni di tessuto sulla gocciolina della soluzione di mordenzatura. Lasciare la griglia di sezione sulla soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni di tessuto mordenzate posizionandole su una goccia di acqua distillata per 60 secondi.

Bloccare le aldeidi residue posizionando la griglia di sezione su una goccia di soluzione di glicina 0,05 molare per 10 minuti a temperatura ambiente. Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro per rimuovere la soluzione di glicina residua. Posizionare la griglia di sezione in 10-20 microlitri di soluzione bloccante per 25 minuti a temperatura ambiente.

Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro e posizionare le sezioni della griglia sul diluente anticorpale per il condizionamento a temperatura ambiente per 10 minuti. Incubare le sezioni della griglia con l'anticorpo primario per 1 ora e 30 minuti in una camera umidificata. Asciugare la griglia con tamponamento e lavare due volte le sezioni della griglia con diluente anticorpale per 5 minuti ciascuna.

Incubare le sezioni della griglia con anticorpo secondario biotinilato per 1 ora in una camera umidificata. Una volta che la griglia è asciugata, lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per 5 minuti ciascuna. Incubare le sezioni della griglia in QD coniugato con streptavidina disponibile in commercio per 1 ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Prevenire l'esposizione alla luce coprendo la camera con un foglio di alluminio. Dopo aver asciugato i bordi della griglia con carta da filtro, lavare le sezioni della griglia posizionandole su goccioline d'acqua per due minuti e asciugare i bordi della griglia.