Una tecnica di colorazione dell'organo a montaggio intero per l'imaging tridimensionale del rene

Prendi un rene di topo fisso. I lipidi nel tessuto causano la dispersione della luce e i pigmenti causano l'assorbimento della luce, rendendo le cellule opache.

Trattare il tessuto con CUBIC-L per la delipidazione e la decolorazione. L'amminoalcol contenuto in CUBIC-L rimuove i lipidi e i pigmenti, riducendo al minimo la dispersione della luce e aumentando la trasparenza.

Anche le molecole detergenti di CUBIC-L permeabilizzano le cellule.

Introdurre un cocktail di anticorpi primari che si lega alla tirosina idrossilasi citoplasmatica nei neuroni dei nervi simpatici e all'actina muscolare liscia alfa nelle cellule muscolari lisce dei vasi.

Aggiungere anticorpi secondari marcati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.

Eseguire la postfissazione tissutale per preservare il trattamento con anticorpi.

Immergere il tessuto in CUBIC-R+ che sostituisce l'acqua e corrisponde all'indice di rifrazione delle proteine, riducendo ulteriormente la dispersione della luce e aumentando la trasparenza.

Sotto un microscopio a fluorescenza a foglio luminoso, i fogli luminosi illuminano il tessuto, eccitando i fluorofori.

Cattura la luce emessa dal fluoroforo e ricostruisci un'immagine tridimensionale, che mostra la distribuzione del nervo simpatico attorno alle arterie del rene.

Per iniziare, eseguire la fissazione per immersione subito dopo la fissazione per perfusione e il prelievo del rene immergendo il rene in paraformaldeide al 4% a 4 gradi Celsius per 16 ore. Dare tre lavaggi usando PBS per due ore ciascuno. Eseguire il processo di decolorazione e delipidazione immergendo il rene fisso in sette millilitri di CUBIC-L al 50% in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri con agitazione delicata a temperatura ambiente.

Dopo sei ore, immergere il rene in sette millilitri di CUBIC-L in un tubo a fondo tondo da 14 millimetri agitando delicatamente a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Aggiorna CUBIC-L ogni giorno. Una volta completate la decolorazione e la delipidazione, utilizzare un cucchiaio di erogazione per la manipolazione del campione e lavare il rene tre volte con PBS a temperatura ambiente per due ore.

Immunocolorare il rene delipidato in anticorpi primari diluiti in una soluzione tampone colorante agitando delicatamente in un agitatore per incubatrice a 37 gradi Celsius per sette giorni. Quindi, lavare il rene con Triton X-100 allo 0,5% in PBS, noto anche come PBST, a temperatura ambiente per un giorno. Per la colorazione secondaria degli anticorpi, trattare il rene con anticorpi secondari nel tampone di colorazione al buio con una leggera agitazione a 37 gradi Celsius per sette giorni. Fissare la macchia con un lavaggio PBST a temperatura ambiente per un giorno.

Dopo la fissazione, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB per tre ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per sei ore. Eseguire la corrispondenza dell'indice di rifrazione immergendo il rene in sette millilitri di CUBIC-R+ al 50% in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri con agitazione per un giorno, seguita da un trattamento con sette millilitri di CUBIC-R+ con agitazione a temperatura ambiente per due giorni.