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Immunologia
0 visualizzazioni • 4:09 min • July 8th, 2025
Prendi la criosezione di una biopsia cutanea di un paziente con malattia di Parkinson racchiusa in un mezzo di inclusione.
Il tessuto comprende un'epidermide più esterna, un derma sottostante e grasso sottocutaneo innervato dai nervi.
Lavare la sezione per rimuovere il mezzo di inclusione. Trasferirlo in una soluzione che blocca la permeabilizzazione, permeabilizzando le cellule e bloccando i siti di legame non specifici.
Immergere la sezione in un cocktail di anticorpi primari per ottenere una marcatura uniforme degli anticorpi, chiamata colorazione flottante.
Gli anticorpi entrano nei neuroni e si legano agli aggregati di alfa-sinucleina distribuiti lungo gli assoni – una forma aggregata caratteristica delle malattie neurodegenerative – e alle idrolasi carbossil-terminali.
Introdurre anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.
Trattare con un colorante legante il DNA fluorescente che colora il nucleo.
Posizionare il fazzoletto su un vetrino, applicare un mezzo di montaggio e sigillare con un vetrino coprioggetti.
Al microscopio confocale, la fluorescenza di entrambi gli anticorpi rivela la presenza di aggregati di alfa-sinucleina lungo gli assoni dei neuroni dermici.
Per iniziare, riempire alcuni dei pozzetti di una piastra fresca da 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Trasferire le sezioni da analizzare dalla piastra di conservazione a quella contenente la soluzione di lavaggio. Lasciare le sezioni nella soluzione di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire ogni sezione in un pozzetto vuoto contenente la stessa soluzione di lavaggio e ripetere il lavaggio. Quindi, aggiungere una soluzione di lavaggio alle sezioni e trasferirle in nuovi pozzetti contenenti 100 microlitri di soluzione bloccante. Incubare a temperatura ambiente per almeno 90 minuti e un massimo di 4 ore.
Diluire gli anticorpi primari, anti-PGP9.5 e anti-5G4 nella soluzione di lavoro. Trasferire le sezioni in nuovi pozzetti contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi primari e incubare per una notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, lavare le sezioni in pozzetti contenenti la soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Diluire gli anticorpi secondari: capra anti-coniglio per rilevare l'anti-PGP9.5 e capra anti-topo per rilevare 5G4 nella soluzione di lavoro.
Trasferire le sezioni lavate in nuovi pozzetti contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi secondari. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo coniugato con gli anticorpi secondari e incubare a temperatura ambiente per 90 minuti.
Successivamente, lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Trasferire le sezioni lavate in pozzetti nuovi contenenti 100 microlitri di DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Quindi, montare le sezioni su una guida nella posizione corretta, evitando di ripiegare erroneamente.
Aggiungere alcune gocce di mezzo di montaggio al vetrino e coprire la sezione con un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i vetrini per una notte. Il giorno successivo, conservare i vetrini in un'apposita scatola a 4 gradi Celsius, facendo attenzione ad evitare l'esposizione alla luce.
Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito o un microscopio confocale, visualizzare le sezioni. Acquisire le immagini tramite una telecamera collegata al microscopio. Quindi, utilizzare un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale per analizzare i segnali positivi in sezioni, in termini di distribuzione spaziale e intensità del segnale, come indicato nel protocollo di testo.