Rilevamento degli anticorpi anti-glicani circolanti con un array di glicani stampato

Iniziare con un glicochip funzionalizzato con sotto-array di glicani stampati organizzati in blocchi di array.

Ogni punto nel sottoarray rappresenta un glicano distinto, un polimero a base di carboidrati con variazioni nella composizione dei monosaccaridi, nella lunghezza della catena e nel modello di ramificazione.

Trattare il glicochip con un tampone bloccante per bloccare i siti di interazione non specifici.

Trasferire il glicochip e introdurre il siero di topo diluito in un tampone integrato con tensioattivo per ridurre al minimo l'aggregazione di anticorpi. Incubare sotto agitazione.

L'agitazione favorisce la distribuzione uniforme del siero, facilitando il legame selettivo degli anticorpi anti-glicani a glicani specifici in base a caratteristiche molecolari distinte.

Lavare con concentrazioni decrescenti di un tampone contenente tensioattivo per disturbare il legame non specifico e risciacquare.

Sovrapporre il glicochip con anticorpi secondari coniugati con biotina anti-topo, interagire con anticorpi anti-glicani pre-legati e lavare.

Introdurre streptavidina marcata con fluoroforo, che si lega agli anticorpi secondari biotinilati. Lavare e rimuovere la soluzione in eccesso.

Scansiona il glicochip e osserva la presenza di macchie di fluorescenza distinte in varie posizioni che suggeriscono anticorpi circolanti specifici per glicani nel siero.

Preparare il buffer #1 attraverso il buffer #4 come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i glicochip e i campioni, posizionare la scatola di conservazione con i vetrini sul tavolo fino a quando non raggiungono la temperatura ambiente. Aprire la scatola e trasferire il glicochip nella camera di incubazione, che deve essere già condizionata con carta da filtro bagnata per mantenere costante l'umidità all'interno della camera.

Nel frattempo, diluire il siero per topi con il tampone 1 in provette da 1,5 millilitri. Omogeneizzare la soluzione di siero per 5 secondi con un miscelatore a vortice. Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero diluito a 37 gradi Celsius per 10 minuti a bagnomaria per evitare l'aggregazione di immunoglobuline. Quindi centrifugare le provette per 3 minuti a 10.000 volte g e 25 gradi Celsius.

Raccogliere il surnatante ed eliminare il materiale precipitato. Posizionare con cura il glicochip nella camera di incubazione. Incubarlo con 1 millilitro di tampone #3 per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie del glicochip. Per 15 minuti, a 25 gradi Celsius, tenere il glicochip in posizione verticale e risciacquarlo con alcune gocce di tampone #3 utilizzando una pipetta di plastica Pasteur.

Quindi, rimuovere con cautela il tampone dalla superficie del glicochip utilizzando carta da filtro. Riposizionare il glicochip nella camera di incubazione. Distribuire il campione di siero diluito sulla superficie del glicochip utilizzando una micropipetta. Assicurarsi che tutte le aree asciutte della superficie del glicochip siano coperte dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta.

Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per 1 ora e 1/2. Dopo l'incubazione, rimuovere il campione in eccesso e immergere il glicochip per 5 minuti nel tampone #3 a 25 gradi Celsius. Passare il glicochip in un contenitore con tampone #4 e, infine, lavare il glicochip con acqua ultrapura.

Centrifugare il glicochip per 1 minuto a 175 volte g e 25 gradi Celsius per rimuovere il liquido. Dopo aver riposizionato il glicochip nella camera di incubazione, stendere una soluzione di capra anti-topo coniugata alla biotina sulla superficie del glicochip. Incubare con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius per un'ora. Rimuovere la frazione non legata e ripetere i passaggi di lavaggio.

Dopo la centrifugazione, incubare il glicochip al buio a 25 gradi Celsius per 45 minuti con 2 microgrammi per millilitro della corrispondente soluzione di streptavidina marcata con fluorocromo nel tampone #2. Dopo aver lavorato al buio per rimuovere la frazione non legata e aver ripetuto le fasi di lavaggio, asciugare il glicochip ad aria.

Per eseguire la scansione dell'array, lasciare il glicochip sul tavolo fino a quando non raggiunge la temperatura ambiente al buio. Allo stesso tempo, accendere lo scanner per vetrini e il laser. Tenendo il microarray, far scorrere il glicochip nella fessura fino a toccare la parte posteriore. Scansiona il glicochip eseguendo Easy Scan e salva la scansione come file .tiff.