Utilizzo di un test ELISA a sandwich per determinare il contenuto di glicoproteine immunogeniche in un vaccino

Iniziare con una piastra del test passivata rivestita con anticorpi monoclonali specifici per la glicoproteina immunogenica antirabbica e un agente bloccante per prevenire interazioni non specifiche.

Introdurre vaccini di riferimento diluiti in serie e testare vaccini antirabbici con contenuto di glicoproteine decrescente. Sigillare la piastra per evitare contaminazioni.

Durante l'incubazione, le glicoproteine immunogeniche interagiscono con gli anticorpi monoclonali rivestiti attraverso uno specifico sito antigenico.

Dopo l'incubazione, rimuovere la pellicola, aspirare il surnatante e lavare la piastra.

Sovrapposizione con anticorpi monoclonali specifici per glicoproteina coniugati con enzimi che si legano a un diverso sito antigenico sulla glicoproteina, formando un immunocomplesso.

Aggiungere una soluzione contenente un substrato e un cromogeno. Quando il substrato interagisce con l'enzima, provoca l'ossidazione del cromogeno, cambiando il colore della soluzione.

Aggiungere una soluzione di arresto per inattivare gli enzimi.

Misurare l'assorbanza e generare una curva di riferimento utilizzando i valori di riferimento del vaccino.

Identificare la regione in cui esiste una relazione lineare tra l'assorbanza e il contenuto di glicoproteine delle diluizioni del vaccino di riferimento. Quindi, estrapolare il contenuto di glicoproteine delle diluizioni del vaccino di prova in base all'assorbanza che rientra in questa regione.

Per lavare la lama, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Quindi, aspirare con cura e trasferire il contenuto del pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per lavare a fondo la piastra sensibilizzata.

Dopodiché, capovolgete la micropiastra e lasciatela asciugare su un foglio di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Ricostituire il vaccino di riferimento in un millilitro di acqua distillata in modo tale che la concentrazione finale della glicoproteina del virus della rabbia sia di 10 microgrammi per millilitro. Preparare una diluizione di 10 volte del vaccino di riferimento ricostituito nel diluente per raggiungere una concentrazione di glicoproteina del virus della rabbia di un microgrammo per millilitro.

Successivamente, eseguire sei diluizioni doppie seriali di questo vaccino di riferimento nel diluente come indicato nella prima tabella del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri di diluente in pozzetti duplicati per fungere da controllo in bianco e 200 microlitri per pozzetto per ogni diluizione del vaccino di riferimento in duplicato.

Quindi, preparare una diluizione di 10 volte del vaccino testato nel diluente e preparare sette diluizioni seriali doppie del vaccino testato nel diluente come indicato nella tabella due del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri di ogni diluizione del vaccino testata in duplice copia su ciascun pozzetto della micropiastra. Coprire la micropiastra con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, rimuovere la pellicola, aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,7%. Per lavare la piastra, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.

Ripetere il processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'antigene non legato. e conservare i trimeri della proteina G legati all'anticorpo rivestito. Capovolgere la micropiastra lavata e lasciarla asciugare su un foglio di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Quindi, distribuire 200 microlitri della diluizione raccomandata dell'anticorpo monoclonale D1 marcato con perossidasi in diluente in ciascun pozzetto.

Coprire la micropiastra con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, rimuovere la pellicola, aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Per lavare la micropiastra, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.

Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'anticorpo marcato con perossidasi non legata. Capovolgere la micropiastra di lavaggio e lasciarla asciugare su un foglio di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi, distribuire 200 microlitri di soluzione cromogena di substrato in ciascun pozzetto. Sigillare la micropiastra con pellicola e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto in ciascun pozzetto per fermare la reazione.

Pulisci con cura la parte inferiore della microlama e inseriscila in uno spettrofotometro. Determinare la densità ottica a 492 nanometri per tutti i pozzetti utilizzati. Raccogli questi dati in un foglio di calcolo per l'analisi. Successivamente, crea grafici sia per la curva di riferimento del vaccino che per i valori di densità ottica come indicato nel protocollo di testo.