JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:39 min • July 8th, 2025
Prendi una piastra a più pozzetti contenente cellule di mammifero incapsulate in un sistema di idrogel che imita l'ambiente naturale della matrice extracellulare.
Rimuovere il terreno di coltura. Trattare con un tampone di fissazione per reticolare le proteine, preservando l'integrità cellulare.
Aggiungere una soluzione contenente detergente per permeabilizzare la membrana cellulare.
Introdurre una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici nei passaggi successivi.
Aggiungere un cocktail di anticorpi primari che entra nelle cellule e si lega specificamente ai filamenti intermedi citoplasmatici e al fattore di trascrizione target.
Rimuovere gli anticorpi non legati. Introdurre anticorpi secondari marcati in fluorescenza e una colorazione nucleare per marcare il DNA in fluorescenza.
Rimuovere le molecole non legate.
Montare la coltura di idrogel su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio.
Utilizzare un microscopio confocale per osservare le cellule immunocolorate.
Per prima cosa, aspirare il terreno da ogni pozzetto. Quindi, lavare i pozzetti con 1 millilitro di DPBS caldo. Al termine del lavaggio, aggiungere 750 microlitri di soluzione di fissaggio a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fissazione da ciascuno dei pozzetti e gettare il fissativo in un contenitore per rifiuti pericolosi. Quindi, aggiungere 1 millilitro di DPBS al campione e gettare immediatamente il DPBS in un contenitore per rifiuti pericolosi.
Successivamente, aggiungere 750 microlitri di soluzione di permeabilizzazione per permeabilizzare il campione per un'ora a temperatura ambiente sul bilanciere, a 15 giri al minuto. Dopo un'ora, aspirare la soluzione di permeabilizzazione e aggiungere 750 microlitri di soluzione bloccante al campione. Lasciare il campione sul bilanciere a temperatura ambiente per tre ore. Quindi, diluire gli anticorpi primari desiderati con la soluzione di diluizione degli anticorpi.
Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun campione. Incubare i campioni per una notte a 4 gradi Celsius. Il giorno seguente, aspirare la soluzione di anticorpi primari. Quindi, lavare i campioni con PBST per un'ora tre volte, a temperatura ambiente, a 15 giri al minuto.
Successivamente, diluire gli anticorpi secondari appropriati e 5 mg/ml di soluzione madre DAPI per ottenere una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione a ciascun campione. Quindi, utilizzare un foglio di alluminio per coprire la piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra a 4 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare i campioni con PBST tre volte, ciascuno per 30 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere. Quindi, posizionare una goccia di terreno di montaggio rigido sulla superficie di un vetrino e posizionare il campione sul mezzo di montaggio. Infine, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i campioni al vetrino di copertura per evitare la contaminazione o il movimento del campione.