Infusione controllata di anticorpi specifici per il peptide Aβ e oligomeri Aβ nell'ippocampo del ratto

Prendete un ratto sveglio con due cannule guida impiantate bilateralmente nell'ippocampo.

Le cannule sono collegate a pompe osmotiche impiantate per via sottocutanea contenenti rispettivamente anticorpi amiloide-beta o Aβ-specifici e anticorpi di controllo.

Un'elevata concentrazione di anticorpi all'interno della pompa induce la diffusione dell'acqua dal tessuto circostante attraverso la sua membrana semipermeabile esterna, espandendo lo strato osmotico.

Questa espansione comprime il serbatoio dell'anticorpo, facilitando il rilascio controllato degli anticorpi.

Collegare due cannule interne a cateteri sterili riempiti d'acqua collegati a una pompa di infusione.

Riempi le cannule con acqua.

Quindi, aspirare un piccolo volume d'aria, creando una bolla.

Ora, riempi le cannule con oligomeri Aβ neurotossici, aggregati solubili di peptidi Aβ.

Inserire le cannule interne nelle cannule guida. Avviare la pompa per un'erogazione controllata degli oligomeri, utilizzando la bolla d'aria per evitare il riflusso e monitorare la velocità di infusione.

Somministrare iniezioni ripetute di oligomeri per la durata richiesta.

Il modello è pronto per studiare le interazioni oligomero-anticorpo Aβ.

Un giorno prima dell'installazione, riempire le pompe osmotiche con l'anticorpo 6E10 o controllare l'anticorpo IgG1 secondo le istruzioni del produttore. Immergere le pompe in acqua distillata sterile e mantenerle a 37 gradi Celsius durante la notte per attivare le pompe.

Una volta che il ratto è stato anestetizzato con isoflurano al 3% e rasato tra le scapole, disinfettare la pelle con una soluzione di clorexidina gluconato al 2% e alcol isopropilico al 2%. Dopo aver praticato un'incisione di 2 centimetri con un bisturi tra le scapole, individuare i cateteri PE-50 collegati alla cannula guida.

Quindi, tagliare le estremità dei cateteri PE-50 contenenti cemento dentale con un bisturi. Collegare le pompe osmotiche ai cateteri PE-50 e aggiungere un po' di cemento dentale alla giunzione della pompa e del catetere per fissare il collegamento. Infine, cucire saldamente la pelle con punti di sutura 4/0. Rimetti l'animale nella sua gabbia su un cuscinetto termico caldo e monitoralo mentre si risveglia dall'anestesia con isoflurano.

Dopo aver preparato la soluzione di oligomero amiloide-beta come precedentemente riportato, lasciare che la soluzione si aggreghi dinamicamente e spontaneamente per 1 ora a temperatura ambiente prima dell'infusione. Quindi, riempire ogni siringa con 5 microlitri di acqua distillata sterile.

Quindi, tagliare due cateteri PE-50 a circa 60 centimetri di lunghezza con un bisturi. Utilizzare due siringhe da 1 millilitro dotate di aghi calibro 21 per riempire entrambi i cateteri con acqua distillata sterile. Mentre le siringhe da 1 millilitro rimangono in posizione, a un'estremità di ciascun catetere, collegare le estremità libere alle siringhe di Hamilton. Rimuovere le siringhe da 1 millilitro e verificare che non ci siano bolle d'aria nei cateteri.

Inserire la cannula interna all'estremità dei cateteri PE-50. Utilizzare le siringhe Hamilton per riempire ogni cannula interna fino a 1 microlitro, quindi creare una bolla d'aria tirando indietro il pistone fino al segno di 2 microlitro.

A questo punto, miscelare la soluzione dell'oligomero beta-amiloide, pipettandola su e giù utilizzando un puntale di minima aderenza. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione. Quindi, riempire entrambe le cannule interne con 1,5 microlitri di soluzione di oligomero beta-amiloide tirando indietro i pistoni a 3,5 microlitri.

Quindi, segnare le linee prima e dopo la bolla d'aria in entrambi i cateteri. Questo serve come punto di controllo dell'infusione in corso. Metti il topo sveglio in una presa per coccole e immobilizza la sua testa. Rimuovere la cannula cieca dalla cannula a due guide, quindi inserire la cannula interna precedentemente preparata nella cannula guida. Verificare che siano completamente inseriti e ben fissati alla base della cannula guida. Ora, libera il topo dalla presa delle coccole e rimettilo nella sua gabbia per limitare lo stress da manipolazione.

Accendere la pompa di infusione e iniettare 1 microlitro di soluzione di oligomero beta-amiloide a una velocità di 0,1 microlitri al minuto. Durante l'infusione, verificare che il pistone della siringa si muova da 3,5 microlitri a 2,5 microlitri e che le bolle d'aria in entrambi i cateteri PE-50 si muovano continuamente. Controllare il ratto per assicurarsi che i cateteri non si attorciglino insieme.

Lasciare la cannula interna in posizione per altri 5 minuti dopo l'infusione per consentire un'efficiente diffusione della soluzione di oligomero beta-amiloide. Dopo l'infusione, riportare il ratto nella presa di coccole e rimuovere la cannula interna e la cannula guida con tappo per prevenire il reflusso della soluzione iniettata. Posizionare la cannula fittizia che si è fermata appena prima del braccio angolare della cannula guida. Infine, riporta l'animale nella sua gabbia.