Una tecnica in vitro per studiare il traffico del recettore del glutammato nei neuroni dell'ippocampo

Prelevare tre campioni di colture neuronali ippocampali su vetrini.

Introdurre anticorpi primari per marcare i recettori del glutammato espressi in superficie.

Aggiungere un terreno condizionato al secondo e al terzo campione per indurre l'endocitosi dei recettori legati agli anticorpi.

Sul terzo campione, aggiungere frammenti di Fab per bloccare gli epitopi sugli anticorpi non endocitati.

Introdurre un inibitore per bloccare l'endocitosi del recettore consentendo il riciclo del recettore in superficie.

In tutti i campioni, fissare le celle e aggiungere una soluzione bloccante per evitare l'etichettatura non specifica.

Introdurre anticorpi secondari marcati con fluorofori per marcare gli anticorpi primari sui recettori legati alla superficie, compresi quelli riciclati.

Permeabilizzare le membrane cellulari.

Aggiungere nuovamente l'anticorpo primario al primo campione per marcare i recettori endocitosi preesistenti.

Introdurre un diverso anticorpo secondario marcato con fluoroforo in tutti i campioni per marcare gli anticorpi primari legati al recettore endocitato, distinguendo tra recettori endocitosi e recettori legati alla superficie.

Utilizzando un microscopio confocale, quantif