Valutazione dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T utilizzando un colorante indicatore di calcio
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 8:14 min. • July 8th, 2025
Iniziare con una sospensione di cellule T di topo e introdurre un colorante indicatore di calcio: l'estere indo-1-acetossimetile.
Il colorante entra nelle cellule, dove le esterasi intracellulari scindono il gruppo acetossimetilico per formare l'Indo-1 impermeabile alla membrana, che mostra una fluorescenza distinta nelle forme prive di calcio e legate al calcio.
Aggiungere anticorpi del recettore Fc per bloccare i siti di interazione aspecifici.
Introdurre anticorpi marcati con fluorofori per colorare sottogruppi di cellule T.
Rimuovere gli anticorpi non legati e colorare con un colorante vitale che colora in modo differenziato le cellule vive e morte.
Nella citometria a flusso, rilevare inizialmente la fluorescenza debole di cellule vive e identificare le cellule T marcate con fluoroforo, quindi misurare la fluorescenza indo-1 all'interno di queste cellule.
Trattare con anticorpi anti-CD3, che interagiscono con il complesso CD3 del recettore delle cellule T e attivano le vie di segnalazione delle cellule T, inducendo l'afflusso di calcio nel citosol.
Il colorante indo-1 interagisce con gli ioni calcio rilasciati, spostando la fluorescenza del colorante dal blu al viola.
Il passag
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