Valutazione dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T utilizzando un colorante indicatore di calcio

Iniziare con una sospensione di cellule T di topo e introdurre un colorante indicatore di calcio: l'estere indo-1-acetossimetile.

Il colorante entra nelle cellule, dove le esterasi intracellulari scindono il gruppo acetossimetilico per formare l'Indo-1 impermeabile alla membrana, che mostra una fluorescenza distinta nelle forme prive di calcio e legate al calcio.

Aggiungere anticorpi del recettore Fc per bloccare i siti di interazione aspecifici.

Introdurre anticorpi marcati con fluorofori per colorare sottogruppi di cellule T.

Rimuovere gli anticorpi non legati e colorare con un colorante vitale che colora in modo differenziato le cellule vive e morte.

Nella citometria a flusso, rilevare inizialmente la fluorescenza debole di cellule vive e identificare le cellule T marcate con fluoroforo, quindi misurare la fluorescenza indo-1 all'interno di queste cellule.

Trattare con anticorpi anti-CD3, che interagiscono con il complesso CD3 del recettore delle cellule T e attivano le vie di segnalazione delle cellule T, inducendo l'afflusso di calcio nel citosol.

Il colorante indo-1 interagisce con gli ioni calcio rilasciati, spostando la fluorescenza del colorante dal blu al viola.

Il passaggio della fluorescenza indo-1 da uno stato privo di calcio a uno legato al calcio conferma l'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T.

Per iniziare, preparare una soluzione madre da 1 microgrammo per microlitro di Indo-1 AM aggiungendo 50 microlitri di DMSO in una fiala, contenente 50 microgrammi di Indo-1 AM. Diluire la soluzione madre in un volume appropriato di cRPMI a una concentrazione di 6 microgrammi per millilitro.

Mettere il terreno a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzare questo mezzo per diluire una sospensione cellulare precedentemente preparata in un rapporto 1 a 1 per ottenere da 5 a 6 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, a una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare per pozzetto, per condizione sperimentale.

Preparare un campione di controllo colorato singolarmente per Indo-1 AM privo di calcio aggiungendo EGTA alle celle caricate con colorante Indo-1. Riparare un pozzo per il controllo biologico negativo senza fluorofori o colorante Indo-1. Preparare un controllo positivo Indo-1 aggiungendo ionomicina a una concentrazione di 50 micromoli alla sospensione cellulare caricata con colorante al citometro a flusso.

Inoltre, preparare un pozzetto per i controlli a colorazione singola per ulteriori popolazioni cellulari, utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi. Quindi aggiungere 2 microgrammi di anticorpo bloccante il recettore FC per milione di cellule e incubare la piastra per 45 minuti, picchiettando ogni 15 minuti per risospendere le cellule.

Dopo l'incubazione, mescolare e rimuovere l'intero volume di cellule dalla piastra e aggiungerlo a provette per microcentrifuga da 1,7 millilitri. Centrifugare e decantare il surnatante. Una volta che le cellule sono state lavate con 1 millilitro di cRPMI preriscaldato, pellettare nuovamente e decantare il surnatante.

Risospendere le cellule in 1 millilitro di cRPMI e incubare ciascuna provetta, lasciando la parte superiore della provetta leggermente aperta per lo scambio di gas, consentendo la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari. Successivamente, preparare una miscela master di tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromo definiti dall'utente e aggiungerla alle cellule a riposo per 1 millilitro del volume cellulare.

Dopo il riposo, pellettare le celle, e lavare il pellet risospendendolo in 1 millilitro di cRPMI raffreddato a 4 gradi Celsius. Ripeti questo passaggio e posiziona i tubi sul ghiaccio. Risospendere i singoli campioni in 500 microlitri di cRPMI privo di rosso fenolo, utilizzando una provetta di flusso in polistirene da 5 millilitri con tappo.

Per mantenere la temperatura utilizzando l'analisi del flusso di calcio, preparare un bagno di perle aggiungendo perle da bagno a un piccolo bagnomaria e riscaldarlo fino a 37 gradi Celsius. Tagliare con cura a metà un tubo conico da 50 millilitri e scartare la parte superiore del tubo. Riempire 3/4 del tubo rimanente con le perle da bagno e lasciarlo raggiungere i 37 gradi Celsius nel bagno di perline.

Posizionare il bagno di perline vicino a un citometro a flusso, insieme a una rastrelliera di polistirolo per posizionare la provetta. Prima dell'analisi sul citometro a flusso, riscaldare le provette singolarmente a 37 gradi Celsius per sette minuti. Accedere al software del citometro a flusso e fare clic sulla scheda Libreria.

Quindi, seleziona i tag fluorescenti per aggiungere Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio. Quindi, seleziona Laser UV in Gruppi di tag fluorescenti e fai clic su Più Aggiungi per aggiungere un nome di tag fluorescente. Scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione del laser, quindi fare clic su Salva.

Continuare con la configurazione dell'esperimento. Fare clic sulla scheda Acquisizione. Aprire o creare un nuovo esperimento e aggiungere i tag fluorescenti desiderati all'esperimento. Creare un gruppo di riferimento e un nuovo gruppo di esempio per l'esperimento ed etichettare entrambi i gruppi.

Nella scheda Acquisizioni, impostare gli eventi da registrare al massimo a 10 milioni, il volume di arresto al volume massimo di 3.000 microlitri e il tempo di arresto al massimo di 36.000 secondi. Acquisisci controlli a colorazione singola per anticorpi coniugati definiti dall'utente, inclusi nel pannello multicolore, e per il colorante funzionale Indo-1.

Aggiungere 50 micromoli di ionomicina al controllo positivo e al vortice Indo-1 legato al calcio. Aggiungere il tubo di flusso alla scheda di iniezione del campione e fare clic su Registra. Quindi, aggiungere il controllo negativo Indo-1 privo di calcio al citometro a flusso e fare clic su Registra.

Scollega i controlli macchiati singolarmente facendo clic sul pulsante Unmix. Una volta completata la rimozione della miscelazione, creare grafici sequenziali utilizzando il foglio di lavoro non miscelato, ad esempio SSCA rispetto a FSCA per la rimozione dei detriti dal campione e SSCA rispetto a SSCH per rimuovere i doppietti.

Quindi crea i cancelli facendo clic su Traccia. Aggiungere un grafico al foglio di lavoro e fare doppio clic all'interno del gate per creare una popolazione recintata a valle. Continuare fino a quando tutte le popolazioni di interesse non saranno contabilizzate. Successivamente, riscaldare i campioni di controllo con colorazione singola precedentemente preparati a 37 gradi Celsius per l'analisi sequenziale.

Configurare il software di citometria a flusso e far scorrere l'acqua deionizzata per 2 o 3 minuti per garantire la stabilità fluidica del citometro a flusso. Impostare i tracciati sequenziali sul foglio di lavoro non miscelato creando punti di iniezione utilizzando i pulsanti di punto di iniezione poligono, rettangolo o ellisse per includere la popolazione di interesse.

Fare doppio clic all'interno del gate e modificare i parametri degli assi y e x in SSCA anziché SSCH. Completare la definizione dei parametri dell'asse facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'asse. Crea un grafico con SSCA rispetto al segnale del colorante di vitalità. Gate le cellule vive, che sono coloranti negativi o amminici.

Le cellule vive negative per la colorazione con morti vivi si raggrupperanno in corrispondenza del segno zero su entrambi gli assi y e x. Fare doppio clic sul grafico interno per creare un nuovo grafico, contenente solo linfociti vivi a cellula singola. Modificare l'asse y in uno rispetto al tempo sull'asse x per visualizzare l'afflusso di calcio.

Quindi, posizionare il campione biologico riscaldato nel SIT della macchina. Esegui i campioni a 2.500-3.000 eventi al secondo a una velocità di flusso media per visualizzare l'afflusso di calcio in un numero limitato di popolazioni cellulari. Aggiungere il tubo successivo al bagno di perline.

In Controllo acquisizione, premere Registra per registrare i dati iniziali per 30 secondi per ottenere un livello basale di segnalazione del calcio nel campione. Quindi fare clic su Stop e rimuovere la provetta dalla porta di iniezione del campione. Aggiungere 30 microgrammi di anti-CD3 non coniugato direttamente nella provetta del campione per avviare l'afflusso di calcio.

Riposizionare rapidamente la provetta sulla porta di iniezione del campione e premere Registra nel software. Registra i dati per sette minuti, osservando il tempo trascorso sotto i controlli di acquisizione nel software. Quindi premere Stop nel software.