JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:24 min • July 8th, 2025
Assumere un tubo contenente una sospensione di batteri intestinali umani.
Aggiungi particelle simili a virus del norovirus umano, o VLP. Le VLP contengono un capside virale intatto ma mancano di RNA genomico, il che le rende non infettive per l'uomo.
Durante l'incubazione, le proteine del capside VLP si legano a carboidrati specifici espressi sulla superficie batterica, formando complessi VLP-batteri.
Centrifugare per pellettare i complessi e scartare le VLP non legate.
Introdurre una soluzione bloccante contenente proteine per bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici, riducendo la colorazione di fondo nelle fasi successive.
Aggiungere anticorpi specifici VLP marcati in fluorescenza e incubare.
Gli anticorpi si legano ai loro siti bersaglio sul capside VLP, marcando i complessi VLP-batteri.
Centrifuga per pellettare i complessi. Scartare gli anticorpi non legati e risospendere il pellet in un tampone per citometria a flusso.
Utilizzando un citometro a flusso, è possibile rilevare i segnali di fluorescenza emessi dai complessi VLP-batteri, consentendo la quantificazione della percentuale di batteri legati nel campione.
Dopo aver preparato i reagenti, gli anticorpi e i batteri come descritto nel manoscritto, assemblare tutti i materiali in una cabina di biosicurezza BSL II.
Le particelle simili a virus per il norovirus umano sono elencate come agenti patogeni BSL II e tutto il lavoro svolto utilizzando VLP deve essere condotto in una cabina di biosicurezza certificata.
Aggiungere 10 microgrammi di VLP del norovirus umano a ciascuna provetta di batteri e mescolare accuratamente mediante pipettaggio. Incubare le provette per 1 ora a 37 gradi Celsius con rotazione costante. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 10.000 volte g per 5 minuti.
Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 millilitro di PBS. Dopo aver ripetuto una volta le fasi di lavaggio, centrifugare nuovamente le provette a 10.000 volte g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di batteri VLP in 150 microlitri di tampone bloccante al 5%.
Un errore comune che si verifica è che le provette vengono scambiate e viene aggiunto il trattamento sbagliato. Per evitare ciò, disporre tutti i tubi in linee che corrispondano al trattamento corretto e aggiungere un trattamento tutto in una volta ai tubi.
Per ogni campione batterico, preparare 50 microlitri di anticorpo umano G2 del norovirus umano diluito. Utilizzando un tampone bloccante al 5%, diluire l'anticorpo da 1 a 125 per i campioni di E. coli. Preparare 50 microlitri di anticorpo isotipo diluito per ogni campione batterico utilizzando gli stessi rapporti di diluizione. Dividere ogni campione di analisi di attacco in aliquote da 350 microlitri trasferendole in provette da centrifuga pulite da 1,5 millilitri.
Per creare controlli non colorati, aggiungere 50 microlitri di tampone bloccante alla prima aliquota di ciascun campione batterico. Per i campioni colorati, aggiungere 50 microlitri di diluizione dell'anticorpo G2 alla seconda serie di aliquote. Creare i controlli isotipici aggiungendo 50 microlitri dell'anticorpo isotipo diluito alla terza serie di aliquote.
Incubare tutti i campioni su ghiaccio e al buio per 30 minuti. Quindi, centrifugare tutti i campioni a 10.000 volte g per 5 minuti. Scartare i surnatanti e risospendere ogni campione in 150 microlitri di FCSB. Anche in questo caso, centrifugare tutti i campioni a 10.000 volte g per 5 minuti. Anche in questo caso, scartare i surnatanti e risospendere i campioni in 100 microlitri di FCSB.
Dopo aver centrifugato i campioni un'ultima volta e aver scartato il surnatante, risospendere i campioni in 150 microlitri di FCSB. Trasferire ogni campione in una provetta contenente 400 microlitri di FCSB per un volume totale di 550 microlitri. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono analizzati mediante citometria a flusso.