Un test in vivo per rilevare la mitofagia nei nematodi transgenici
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:39 min. • July 8th, 2025
Prendiamo i nematodi transgenici, con cellule muscolari della parete corporea che esprimono DCT-1 marcato con fluoroforo verde, una proteina della membrana mitocondriale esterna, e una LGG-1 marcata con fluoroforo rosso, una proteina della membrana fagofora.
Posiziona i vermi sopra un terreno di coltura contenente un farmaco che induce la mitofagia.
Il farmaco danneggia i mitocondri cellulari, avviando la mitofagia o la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati.
DCT-1 sui mitocondri danneggiati subisce ubiquitinazione e fosforilazione, facilitando l'interazione con LGG-1 sulla membrana del fagoforo.
Il fagoforo si espande intorno ai mitocondri per formare un autofagosoma mirato alla degradazione lisosomiale.
Posizionare i nematodi in un anestetico su un vetrino da microscopio per immobilizzarli e posizionare un vetrino coprioggetti.
Sotto un microscopio a fluorescenza, visualizzare le macchie gialle all'interno delle cellule muscolari, indicando la co-localizzazione di DCT-1 che emette fluorescenza verde e LGG-1 che mostra fluorescenza rossa. Questo conferma l'insorgenza della mitofagia.
Il primo giorno, prelevare larve L4 di animali transgenici che esprimono sia DCT-1::GFP ch
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