JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 7:32 min. • July 8th, 2025
Per rilevare un biomarcatore proteico associato alla malattia, prelevare una piastra di dosaggio immunologico.
La piastra contiene le matrici di separazione e impilamento preriempite necessarie per la separazione delle proteine in base alle dimensioni.
Caricare le proteine e i reagenti per il dosaggio immunologico in pozzetti di piastre distinti.
Avviare l'esecuzione all'interno di un analizzatore CEI. La cartuccia capillare nell'analizzatore aspira le matrici per formare un gel all'interno di ciascun capillare.
Il capillare aspira quindi le proteine. Durante l'elettroforesi, le proteine migrano e si separano in base al loro peso molecolare.
L'analizzatore introduce la luce UV, immobilizzando le proteine nel capillare.
Il tampone di lavaggio rimuove le matrici e le proteine non legate. Il buffer di blocco quindi fluisce all'interno, bloccando siti di interazione non specifici.
L'analizzatore introduce gli anticorpi primari che si legano al biomarcatore, seguiti dagli anticorpi secondari coniugati con perossidasi che interagiscono con gli anticorpi primari.
Lavare e quindi aggiungere il substrato di chemiluminescenza. La perossidasi ossida il substrato, emettendo luminescenza.
Misura l'intensità della luminescenza e confrontala con lo standard proteico per il rilevamento dei biomarcatori.
Dopo aver raccolto 100 microlitri di lisati piastrinici umani da pazienti affetti da SLA e soggetti sani, compila i modelli generati internamente per il layout dei capillari e la preparazione del campione. La tabella di preparazione della miscela del campione è dinamica e calcola automaticamente la quantità di volume da rimuovere dalla fonte. Mettere tutti i reagenti del test sul ghiaccio, ad eccezione della confezione standard che deve rimanere a temperatura ambiente.
Per preparare la master mix fluorescente, aggiungere 40 microlitri di acqua deionizzata a una provetta trasparente di DTT e aggiungere 20 microlitri di tampone campione 10X e 20 microlitri della soluzione DTT da 400 millimolari preparata alla provetta rosa del kit di analisi.
Per preparare la scala biotinilata, aggiungere 16 microlitri di acqua deionizzata, 2 microlitri di tampone campione 10X e 2 microlitri della soluzione DTT da 400 millimolari preparata alla provetta bianca fornita nel kit. Dopo una miscelazione delicata, trasferire la soluzione ladder in una provetta PCR da 200 microlitri prima della denaturazione.
Aggiungere 1,5 microlitri di tampone campione 10X e 148,5 microlitri di acqua deionizzata a una provetta da microcentrifuga da 600 microlitri e vortice per mescolare, prima di posizionare la provetta sul ghiaccio. Aggiungere gli anticorpi di interesse direttamente al diluente, come indicato nella tabella, e lavare più volte la punta della pipetta per ottenere una soluzione anticorpale omogenea.
Per preparare la miscela di campioni capillari, aprire tutte le provette PCR e aggiungere aliquote da 1,6 microlitri di tampone per campioni fluorescente 5X a ciascuna provetta, come indicato nella tabella, utilizzando una tecnica di pipettaggio inverso, chiudendo immediatamente ciascuna provetta quando viene aggiunto il tampone. Quando tutto il tampone è stato aggiunto, aprire tutte le provette e aggiungere un tampone di campione 0,1x in volumi come indicato nella tabella, chiudendo immediatamente ciascuna provetta man mano che viene aggiunto il tampone.
Quindi, aprire tutte le provette e aggiungere i campioni di proteine come indicato nella tabella, quindi chiudere immediatamente il tappo di ciascuna provetta. Una volta aggiunti tutti i campioni, centrifugare brevemente tutte le provette in una centrifuga da banco. Vortice per mescolare e centrifugare nuovamente i campioni.
Al termine della seconda centrifugazione, inserire tutte le provette in un termociclatore con coperchio riscaldato e denaturare i campioni nelle condizioni indicate. Al termine della denaturazione, centrifugare, miscelare e centrifugare nuovamente i campioni e posizionare tutte le provette in un rack per provette su ghiaccio.
Usando la figura come guida, aggiungere 10 microlitri di streptavidina perossidasi di rafano al pozzetto D1, 10 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato ai pozzetti da D2 a D5, 10 microlitri di diluente anticorpale a ciascun pozzetto nella fila B e al pozzetto C1, 10 microlitri dell'anticorpo primario appropriato ai pozzetti da C2 a C25, 5 microlitri di scala biotinilata dalla provetta PCR numero 1 al pozzetto A1, 3 microlitri di campione nelle file da A2 a A25 e 15 microlitri di perossido di luminol appena preparato in ciascun pozzetto della riga E.
Il pipettaggio della miscela del campione e dei reagenti nel pozzetto nel pozzetto nell'ordine corretto è fondamentale per il successo dell'esperimento, quindi deve essere fatto con molta attenzione.
Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto del tampone di lavaggio designato e centrifugare il contenuto della piastra.