Una tecnica di immunofluorescenza per la localizzazione di proteine virali in cellule infette

Iniziare con un vetrino contenente cellule ospiti aderenti.

Aggiungi virus e consenti loro di entrare nelle cellule ospiti.

Rimuovere il mezzo esaurito. Aggiungere terreno fresco per consentire la sintesi e il trasporto delle proteine virali.

Utilizzare la paraformaldeide per preservare la morfologia cellulare e la posizione delle proteine.

Aggiungere molecole di detersivo per rendere le cellule permeabili.

Applicare un buffer di blocco per bloccare i siti di associazione non di destinazione.

Aggiungere gli anticorpi primari che legano le proteine virali bersaglio. Rimuovere gli anticorpi non legati.

Sovrapposizione con anticorpi secondari rossi coniugati con fluorofori per marcare in fluorescenza le proteine virali. Rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere un mezzo di montaggio fluorescente contenente colorante nucleare per colorare i nuclei.

Utilizzando la microscopia confocale, osservare la posizione delle proteine virali fluorescenti rosse e dei nuclei ospiti fluorescenti blu.

Un segnale rosso più forte intorno all'area blu indica la localizzazione citoplasmatica, mentre un segnale più forte all'interno suggerisce la localizzazione nucleare.

Livelli di segnale uguali all'interno e intorno all'area blu indicano che le proteine si trovano sia nel nucleo che nel citoplasma.

Da 20 a 24 ore prima dell'infezione virale, seminare 5 x 10⁴ cellule di polmone embrionale umano o di fibroblasti HEL per pozzetto su un vetrino sfalsato di 4 pozzetti da 11 millimetri in terreno di crescita per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica.

È importante far oscillare accuratamente il vetrino per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, facendo attenzione a evitare la fuoriuscita del terreno di coltura. Il giorno successivo, sostituire i surnatanti delle colture confluenti dal 70% all'80% con Medium-199 contenente 4-10 unità formanti placche per cellula e posizionare il vetrino a 37 gradi Celsius agitando per 1 ora.

Al termine dell'incubazione, sostituire i surnatanti con un terreno di coltura fresco e rimettere le cellule nell'incubatore per il periodo di infezione sperimentale appropriato. Per la colorazione in immunofluorescenza delle cellule infettate dal virus, lavare rapidamente le cellule tre volte con PBS, seguita da un'incubazione di 8-10 minuti in 200 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS per pozzetto. Al termine della fissazione, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS per lavaggio e permeabilizzare le cellule con 100 microlitri di tensioattivo non ionico allo 0,2% per pozzetto per 5-10 minuti.

Lavare le cellule permeabilizzate tre volte in PBS come dimostrato e aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto per un'incubazione di 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la concentrazione appropriata dell'anticorpo primario di interesse a ciascun pozzetto per un'incubazione a temperatura ambiente di 2 ore.

Al termine dell'incubazione, rimuovere l'eventuale anticorpo primario non legato con tre lavaggi di 10 minuti in un tampone bloccante fresco e aggiungere un anticorpo secondario appropriato a ciascun pozzetto per un'incubazione di 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in un tampone bloccante come dimostrato, seguito da un lavaggio in PBS, e aggiungere una goccia di terreno di montaggio anti-sbiadimento, integrato con DAPI a ciascun pozzetto. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino e sigillare il vetrino coprioggetti con smalto trasparente.

L'applicazione di una leggera pressione durante il montaggio del vetrino coprioggetti rimuoverà qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso, contribuendo a garantire l'acquisizione di immagini di alta qualità.

Per analizzare la distribuzione nucleare e citoplasmatica di ICP0, aprire il progetto nel software applicativo confocale e selezionare un'immagine. Aprire la scheda Quantità e selezionare Ordina regioni di interesse dal menu Strumenti. Selezionare Disegna linea e tracciare una linea longitudinale attraverso la cella da analizzare. Apparirà un istogramma che mostra l'intensità della fluorescenza lungo la linea sia per la proteina di interesse che per il DAPI.

Sulla base della colorazione di fondo, impostare una soglia costante per l'intensità della proteina di interesse per l'analisi della distribuzione subcellulare della proteina in ogni esperimento. Se il segnale proteico, in media, è al di sotto della soglia nella regione nucleare, ma è al di sopra della soglia oltre il limite DAPI, classificare il segnale proteico come prevalentemente localizzato all'interno del citoplasma.

Se il segnale proteico è al di sopra della soglia in tutto il nucleo e oltre il limite del segnale DAPI, raggruppare il segnale proteico come nucleo più localizzazione citoplasmatica. Se il segnale proteico è al di sopra della soglia nel nucleo, ma in media è al di sotto della soglia al di fuori del confine del segnale DAPI, raggruppare il segnale proteico come una localizzazione nucleare.