Misurazione dei livelli di immunoglobulina G rispetto a un vaccino di prova in un siero di topo

Iniziare con una piastra multipozzetto rivestita con un vaccino di prova e bloccare i siti di interazione non specifici.

Acquisire un campione di siero da un topo a cui è stato iniettato il vaccino di prova.

Questo siero contiene immunoglobuline G, o IgG, anticorpi che riconoscono il vaccino di prova.

Ai pozzetti rivestiti di vaccino, aggiungere campioni di siero diluiti in serie.

Le IgG si legano al vaccino. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere anticorpi secondari coniugati con perossidasi che si legano alle IgG. Rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Aggiungere un substrato cromogenico. La perossidasi interagisce con il substrato, generando un prodotto di colore blu.

Introdurre un acido per fermare la reazione. La variazione del pH fa ingiallire la soluzione.

Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'intensità del colore di ciascun pozzetto per determinare la concentrazione di IgG nel campione di siero.

Per il rivestimento dell'antigene del saggio di immunoassorbimento enzimatico, o piastra ELISA, diluire l'antigene della proteina HI a 10 microgrammi per millilitro con una soluzione di rivestimento e aggiungere 100 microlitri di antigene diluito per pozzetto nella piastra ELISA. Incubare la piastra a 4 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, lavare la piastra con 300 microlitri di PBST per pozzetto.

Sigillare i pozzetti con 300 microlitri di soluzione sigillante per pozzetto per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi, diluire tre microlitri di siero di topi di ciascun gruppo sperimentale 100 volte aggiungendo 297 microlitri di PBST e agitare il siero diluito. Aggiungere 100 microlitri di siero diluito per pozzetto nella piastra ELISA rivestita per ogni campione di siero. Allo stesso modo, diluire i sieri di controllo positivo e negativo 100 volte con PBST, aggiungendo 4 microlitri di siero di controllo positivo o negativo a 396 microlitri di PBST seguito da miscelazione a vortice.

Per eseguire la diluizione a doppio rapporto, aggiungere 200 microlitri del siero sperimentale precedentemente diluito alla prima fila della piastra ELISA rivestita. Quindi, aggiungere 100 microlitri di PBST a tutti i pozzetti, ad eccezione di quelli delle file uno e 12. Quindi, regolare la pistola per pipette a 100 microlitri e trasferire 100 microlitri di siero dalla prima alla seconda fila contenente PBST.

Mescolare il contenuto nella seconda fila 10 volte, utilizzando la pistola per pipette. Allo stesso modo, eseguire diluizioni successive 1:2 del siero fino alla fila 11. Una volta fatto, scartare 100 microlitri di liquido dalla fila 11.

Aggiungere 100 microlitri di siero diluito negativo e positivo a ciascun pozzetto corrispondente nella riga 12, seguendo il modello del campione. Sigillare la piastra ELISA con pellicola trasparente e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Nel frattempo, diluire l'anticorpo secondario anti-IgG di topo HRP 10.000 volte aggiungendo PBST. Dopo un'incubazione di un'ora, lavare la piastra ELISA con 300 microlitri di PBST per pozzetto per pulire gli anticorpi non legati. Quindi aggiungere 100 microlitri dell'anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 40 minuti.

Lavare la piastra con 300 microlitri di PBST, per pozzetto. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione per lo sviluppo del colore TMB a ciascun pozzetto. Posizionare i piatti a 37 gradi Celsius e al riparo dalla luce per 10 minuti. Dopodiché, terminare immediatamente la reazione con 50 microlitri di acido solforico a 2 molari. Rilevare la densità ottica o i valori OD a 450 nanometri, utilizzando un marcatore enzimatico entro 15 minuti dall'interruzione.