Un test per misurare l'accumulo di una sonda antibiotica fluorescente nelle cellule batteriche

Prelevare provette contenenti campioni batterici.

Nel campione di prova, aggiungere molecole inibitrici per bloccare la pompa di efflusso antibiotico dei batteri.

Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Aggiungere sonde antibiotiche coniugate con fluorofori che entrano nelle cellule batteriche.

Nel campione di controllo, la pompa di efflusso estrude le sonde nel mezzo extracellulare.

Nel campione trattato con inibitore, la pompa di efflusso ostruita non può espellere le sonde, causandone l'accumulo.

Centrifugare i campioni. Eliminare il surnatante contenente le sonde extracellulari.

Aggiungere il tampone di lisi seguito dal lisozima per indebolire la parete cellulare batterica.

Eseguire cicli di congelamento-scongelamento, sonicazione ed esposizione ad alta temperatura per lisare le cellule.

centrifuga. Trasferire il surnatante su una membrana filtrante.

Lavare e raccogliere il filtrato contenente le sonde.

Misurare l'intensità di fluorescenza del filtrato.

Una maggiore intensità di fluorescenza nei campioni batterici trattati con inibitori suggerisce la perdita della funzione di efflusso, con conseguente accumulo di sonde intracellulari.

Per l'analisi dell'accumulo della sonda, s