JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:02 min. • July 8th, 2025
Prelevare provette contenenti campioni batterici.
Nel campione di prova, aggiungere molecole inibitrici per bloccare la pompa di efflusso antibiotico dei batteri.
Centrifugare ed eliminare il surnatante.
Aggiungere sonde antibiotiche coniugate con fluorofori che entrano nelle cellule batteriche.
Nel campione di controllo, la pompa di efflusso estrude le sonde nel mezzo extracellulare.
Nel campione trattato con inibitore, la pompa di efflusso ostruita non può espellere le sonde, causandone l'accumulo.
Centrifugare i campioni. Eliminare il surnatante contenente le sonde extracellulari.
Aggiungere il tampone di lisi seguito dal lisozima per indebolire la parete cellulare batterica.
Eseguire cicli di congelamento-scongelamento, sonicazione ed esposizione ad alta temperatura per lisare le cellule.
centrifuga. Trasferire il surnatante su una membrana filtrante.
Lavare e raccogliere il filtrato contenente le sonde.
Misurare l'intensità di fluorescenza del filtrato.
Una maggiore intensità di fluorescenza nei campioni batterici trattati con inibitori suggerisce la perdita della funzione di efflusso, con conseguente accumulo di sonde intracellulari.
Per l'analisi dell'accumulo della sonda, strisciare le scorte di glicerolo dei ceppi batterici su piastre di agar LB per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. La mattina dopo, raccogli una singola colonia dal piatto per la coltura notturna in brodo di lisogenia a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, diluire la coltura notturna di circa 50 volte in terreno fresco.
Quando la coltura raggiunge la fase di metà logaritmica, pellettare i batteri mediante centrifugazione e decantare il terreno. Risospendere i batteri in 1 millilitro di PBS e centrifugare nuovamente i batteri. Decantare il surnatante e risospendere il pellet lavato in PBS a una densità ottica a 600 nanometri di due.
Aggiungere 10,1 microlitri di CCCP da 10 millimolari in PBS a 1 millilitro di batteri e incubare i batteri a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere i batteri mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 1 millilitro di soluzione antibiotica fluorescente micromolare da 10 a 100 micromolari in PBS.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, lavare le cellule mediante centrifugazione quattro volte in 1 millilitro di PBS freddo per lavaggio. Dopo il lavaggio, lisare i batteri con 180 microlitri di tampone di lisi e 70 microlitri di lisozima.
Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, congelare-scongelare i batteri tre volte a meno 78 gradi Celsius per 5 minuti e 34 gradi Celsius per 15 minuti rispettivamente. Dopo l'ultimo ciclo di congelamento-scongelamento, sonicare il campione per 20 minuti, seguito da un'incubazione di 30 minuti a 65 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, raccogliere il campione lisato mediante centrifugazione e filtrare il contenuto della provetta attraverso una membrana filtrante da 10 kilodalton. Lavare il filtro quattro volte con 100 microlitri di acqua per lavaggio e aliquotare ogni lavaggio in pozzetti individuali di una piastra nera a fondo piatto da 96 pozzetti. Quindi misurare l'intensità della fluorescenza su un lettore di piastre con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per il fluoroforo.