JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:21 min. • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule natural killer, o NK. Aggiungi vettori lentivirali che comprendono enzimi virali e molecole di RNA ingegnerizzate che codificano una proteina fluorescente.
Aggiungi polimeri cationici e sedimenta le cellule e i virus.
I polimeri neutralizzano le cariche negative sia sul virus che sulla cellula, facilitando la fusione della membrana.
L'RNA viene trascritto inversamente in DNA e integrato nel genoma dell'ospite, consentendo l'espressione della proteina fluorescente.
Aggiungere terreni integrati con la citochina interleuchina-2, o IL-2.
L'IL-2 innesca la segnalazione intracellulare che promuove la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule NK, preservando l'espressione transgenica.
Trasferire la miscela in un pozzetto rivestito con anticorpi che si legano a specifici immunorecettori sulle cellule NK, innescandole a rilasciare citochine antivirali.
Quantificare le citochine rilasciate per valutare l'impatto del polimero sulla produzione di citochine.
Aggiungere coloranti fluorescenti per marcare il DNA delle cellule necrotiche.
Utilizzando la citometria a flusso, identificare le cellule vive e quantificare il segnale della proteina fluorescente per misurare l'efficienza della trasduzione indotta dal polimero.
Sospendere le cellule NK primarie di topo o umano nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a 0,5 x 105 per millilitro di terreno con surnatante di lentivirus GFP a un MOY di 5, 10 e 20 e in presenza di polibrene, protamina solfato o destrano.
Centrifugare le piastre a 1.000 volte g per 60 minuti. Quindi, senza decantare il surnatante, coltivare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius infuso con il 5,2% di anidride carbonica durante la notte. Dopo che le cellule sono state lavate con 10 millilitri di PBS, utilizzare 2 millilitri di terreno RPMI 1640 con IL-2 per risospendere le cellule.
Il giorno prima della raccolta delle cellule, rivestire piastre di polistirene altamente assorbenti con 96 pozzetti con 2,5 microgrammi per millilitro di anticorpi monoclonali anti-NKG2D e incubare le piastre a temperatura ambiente o in frigorifero per una notte. Il giorno seguente, utilizzare 100 microlitri di PBS per lavare ogni pozzetto tre volte.
Raccogliere le cellule NK trasdotte picchiettando delicatamente le piastre. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Da 16 a 18 ore dopo l'attivazione, utilizzare una pipetta multicanale per raccogliere i surnatanti. Quindi, utilizzando le citochine ricombinanti di un kit ELISA, generare una curva standard e quantificare le citochine come l'interferone-gamma nel surnatante.
Per testare la vitalità delle cellule NK, quattro giorni dopo la trasduzione, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS freddo due volte. Quindi, raccogli le cellule e usa un'annessina-V/7-ammino-actinomicina D per colorarle. Utilizzare la citometria a flusso per determinare la percentuale di cellule necrotiche tra le cellule NK trasformate e analizzare i dati secondo il protocollo di testo.