JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:55 min. • July 8th, 2025
Iniziare con una sospensione di cellule T e trattarle con lentivirus CAR che trasportano un gene per il recettore chimerico dell'antigene o lentivirus CAR e CRISPR.
Il lentivirus CRISPR contiene geni per l'RNA guida e la nucleasi Cas9, nonché un gene di resistenza agli antibiotici.
Sia i lentivirus CAR che CRISPR interagiscono con le cellule T e rilasciano il loro RNA.
Questi RNA vengono trascritti inversamente e convertiti nel DNA corrispondente, che si integra nel DNA delle cellule T.
Ciò consente la sintesi di proteine CAR, RNA guida e proteine Cas9.
L'RNA guida forma un complesso con Cas9, che riconosce e si lega specificamente al gene bersaglio sul DNA delle cellule T.
Nel frattempo, Cas9 sfende il DNA, creando una rottura a doppio filamento.
Questa rottura viene riparata tramite l'unione di estremità non omologa, un meccanismo di riparazione soggetto a errori, con conseguente modifica del gene bersaglio.
Questo genera cellule T geneticamente modificate con recettori chimerici dell'antigene.
Trattare le cellule con antibiotici per eliminare le cellule T non modificate e isolare selettivamente le cellule CAR T geneticamente modificate.
Per interrompere il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, utilizzare un RNA guida, come descritto nel manoscritto. Incubare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungerle alle cellule 293T che hanno raggiunto la confluenza dal 70% al 90% e coltivare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius, 5% di CO2 per produrre lentivirus.
A 24 e 48 ore, raccogliere e concentrare il surnatante contenente virus mediante ultracentrifugazione in provette da ultracentrifuga da 50 millilitri e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Quindi, il primo giorno, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette.
In un laboratorio approvato BSL-2 plus, per generare cellule T CAR, aggiungere il lentivirus CAR19 e il lentivirus CRISPR mirato a GM-CSF alle cellule T stimolate. Il terzo e il quinto giorno, per le cellule T modificate con lenti-CRISPR trasdotte con successo che trasmettono resistenza alla puromicina, trattare le cellule con puromicina dicloridrato a una concentrazione di 1 microgrammo di puromicina per millilitro.