Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Un approccio affidabile e utile per rilevare modificazioni degli istoni sui geni impianto specifico è descritto. L'approccio combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e real-time PCR quantitativa. Esso consente il rilevamento di modifiche degli istoni su specifici geni con un ruolo in diversi processi fisiologici.

Il seguente metodo offre un rilevamento affidabile e sensibile di specifiche modificazioni della cromatina su geni vegetali selezionati. Prima cross-linking di istoni e DNA modificati con formaldeide. Quindi estrarre e sonicare la cromatina per facilitare l'immunoprecipitazione con anticorpi specifici per la modifica.

Infine, analizzare la reazione del chip mediante il collegamento delle scorie di complessi di DNA istonici e la PCR quantitativa in tempo reale specifica per il gene. Nelle piante, questo approccio può fornire intuizioni molecolari come le specifiche modificazioni istoniche associate alla fotosintesi C 4 nel labirinto e all'immunità sistemica in Arabidopsis. Il vantaggio principale dell'immunoprecipitazione della cromatina rispetto ai metodi esistenti come la spettrometria di Marte è che questa tecnica consente il rilevamento di modifiche dell'istina su sequenze selezionate nel genoma delle piante.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il protocollo prevede un paio di passaggi la cui corretta esecuzione è la chiave per il successo della procedura. In questo video, utilizziamo l'analisi dei chip per fornire informazioni sulla deregolazione dell'espressione genica nella pianta modello Arabidopsis ANA che dimostra la procedura sarà mic yakovich, uno studente di dottorato Per ogni campione iniziare con un raccolto di due grammi di foglie di arabidopsis e un tubo di plastica da 50 millilitri. Riempi il segno di 40 millilitri con il tampone reticolante e posiziona una spugna filtrante su misura proprio sopra la superficie del tampone per assicurarti che le foglie rimangano immerse.

A questo punto, mettere i campioni in un essiccante sottovuoto e filtrarli per 10 minuti. Per fermare la reazione di reticolazione, aggiungere 2,5 millilitri di glicina a due molari e mescolare per inversione. Quindi infiltrarsi di nuovo per cinque minuti, continuare ad aspirare, infiltrarsi per altri cinque minuti.

Quindi scartare il fluido mentre si raccolgono le foglie su un setaccio. Dopo aver lavato le foglie due volte con un litro d'acqua in un bicchiere di plastica, asciugatele accuratamente con carta assorbente, raccoglietele in un tubo di plastica fresco e congelatele in azoto liquido. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento della cromatina.

Utilizzando un mortaio e un pestello raffreddati ad azoto liquido, macinare i campioni congelati fino a ridurli in polvere fine. Trasferire la polvere in un tubo di plastica da 50 millilitri. Sospendi la polvere in 30 millilitri di tampone di estrazione numero uno e incuba per 15 minuti a quattro gradi Celsius su uno shaker sopraelevato.

Passare la sospensione attraverso quattro strati di tela a specchio in un tubo di plastica fresco da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, scartare la natina SUP. Successivamente, utilizzare un pennello per risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone di estrazione numero due, quindi aggiungere altri 950 microlitri di tampone di estrazione.

Numero due, trasferire la sospensione in una provetta micro fuge da 1,5 millilitri e centrifugare per 10 minuti. Nel frattempo, preparare due provette da micro-fuge da un millilitro contenenti 1,5 millilitri di tampone di estrazione. Numero tre.

Successivamente, scartare i surnatanti per sospendere gradualmente il pellet in 300 microlitri di tampone di estrazione. Numero tre. Innanzitutto, aggiungi un piccolo volume di buffer.

Numero tre, sospendere il pellet con un pennello e poi aggiungere il tampone rimanente. Ora sovrapporre accuratamente i campioni sopra le provette preparate con 1,5 millilitri di tampone di estrazione. Numero tre, garantire che le due fasi non mescolino campioni di centrifuga per un'ora a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius.

Scartare il sup natina e sospendere la pallina di cromatina con un pennello in 300 microlitri di tampone di sonicazione cromatona sonicata fino a una dimensione di DNA di circa 400 paia di basi. Durante la sonicazione, assicurarsi che la cromatina non venga riscaldata oltre i 30 gradi Celsius circa. Per proteggere i legami incrociati sensibili al calore, centrifugare il campione sonicato per precipitare il materiale insoluto e raccogliere il surnatante in provette microfuge da due millilitri contenenti agarosio proteico e tampone legante gli anticorpi.

Aggiungere 200 microlitri del preparato di cromatina del campione. Incubare le provette per un'ora su un agitatore a soffitto. Dopo la centrifugazione, raccogliere i surnatanti del campione e aliquotare 30 microlitri di proteine.

A aros a provette fresche da 1,5 millilitri per la determinazione della concentrazione di cromatina del materiale in ingresso. Riserva 40 microlitri di cromatina sonicata. Quindi aggiungere 400 microlitri della sospensione di cromatina sonicata ai 30 microlitri di aros proteici e una quantità appropriata di anticorpi specifici per la modifica, incubare per una notte su un agitatore a soffitto a quattro gradi Celsius.

Raccogliere le perle mediante lubrificazione per due minuti a 440 volte G.Rimuovere il surnatante ed eseguire successivi lavaggi di 10 minuti di pellet di perline con 900 microlitri del rispettivo tampone su uno shaker a soffitto. Dopo il lavaggio finale, rimuovere completamente il tampone rimasto. Per liberare il DNA dagli istoni, aggiungere 400 microlitri di tampone di reticolazione D alle perle e il campione di input da 40 microlitri conservato in precedenza a vortice per cinque minuti di campioni di centrifuga e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte.

Ora, purifica il DNA con un kit di purificazione del DNA commerciale ed esegui la R-T-P-C-R quantitativa convenzionale in tempo reale specifica per locus specifica. In questo esempio, l'espressione del gene di difesa Arabidopsis ANA PR two è stata indotta da Benzo Diazole, un analogo sintetico dell'ormone vegetale acido salicilico. I risultati dimostrano che l'attivazione dell'espressione di PR 2 è associata ad un aumento dell'acetilazione dei residui di lisina sugli istoni H tre e H 4 sul promotore PR due.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'aggiunta del tampone di estrazione uno alla polvere fogliare provoca una sovrapressione nel tubo fcon chiuso. Ricordati di aprire il tubo di tanto in tanto. Inoltre, ricordarsi di non rimuovere il pennello dopo la sospensione dei pellet prima dell'aggiunta del tampone successivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare le sue modifiche e le leve piane in cui si formano la reticolazione basata sull'aldeide di DNA e istoni, l'isolamento dell'immunoprecipitazione della cromatina e la quantificazione del DNA locus specific per rispondere a domande chiave sul ruolo della cromatina e delle sue modifiche in diversi campi della biologia vegetale.