JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:32 min. • July 8th, 2025
Prendere una piastra a micropozzetti rivestita con frammenti di fibronectina ricombinante e aggiungere cellule T CD8-positive murine attivate.
Introdurre vettori retrovirali contenenti un RNA transgenico che codifica per un recettore chimerico dell'antigene o CAR.
Copri il piatto e sigillalo in un sacchetto per evitare contaminazioni. Centrifugare la piastra a bassa velocità per facilitare l'interazione virus-cellula.
La fibronectina si lega al virus e alla cellula, colocalizzandoli per migliorare il trasferimento genico mediato dal virus.
Dopo la centrifugazione, rimuovere la sacca sigillata e incubare la piastra in condizioni fisiologiche.
L'involucro del vettore virale si fonde con la membrana cellulare, rilasciando l'RNA virale e gli enzimi.
Gli enzimi virali trascrivono l'RNA rilasciato e integrano il DNA risultante nel genoma ospite, consentendo alle cellule di esprimere i CAR legati alla superficie.
Il CAR comprende un dominio di legame dell'antigene specifico per l'antigene bersaglio e domini di segnalazione per l'attivazione delle cellule T.
Le cellule CAR T antigene-specifiche sono pronte per i saggi a valle.
Il giorno 1, preparare piastre rivestite di frammenti di fibronectina umana aggiungendo 0,5 millilitri di fibronectina ai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e incubandola per una notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di fibronectina e aggiungere 1 millilitro di BSA al 2% in PBS per pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare i pozzetti trattati con 1 millilitro di PBS sterile. La piastra è pronta per l'uso dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio.
Contare le cellule T CD8 attivate utilizzando il blu di tripano. Raccoglierli per centrifugazione e risospenderli a 5 milioni di cellule vitali per millilitro per la trasduzione. Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare CD8 attivata a ciascun pozzetto della piastra rivestita di fibronectina. Quindi, aggiungere da 1,5 a 2 millilitri del terreno contenente il virus precedentemente preparato e mescolare con un movimento vorticoso per erogare uniformemente le cellule.
Sigillare la piastra in un sacchetto con chiusura a zip e centrifugarla a 2000 volte g per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la piastra dalla centrifuga e portarla in una cabina di sicurezza biologica. Rimuovere con cautela il sacchetto di plastica e assicurarsi che l'esterno della piastra non sia contaminato dal fluido. Trasferire la piastra in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Dopo 4 ore, rimuovere 1 millilitro di terreno da ogni pozzetto. Sostituirlo con 1 millilitro di terreno di coltura a cellule T completo preriscaldato e rimettere la piastra nell'incubatore.