Rimozione selettiva della microglia da una coltura di neuroni di granuli cerebellari di ratto

Prendi un cervelletto di ratto raccolto e taglialo in frammenti.

Trasferire i frammenti in una provetta contenente tripsina e incubare.

La

tripsina digerisce la matrice extracellulare del tessuto, allentando i neuroni dei granuli cerebellari, così come le cellule non neuronali come la microglia e gli astrociti.

Aggiungere un tampone contenente un inibitore della tripsina e la DNasi. L'inibitore inattiva la tripsina mentre la DNasi degrada il DNA contaminante.

Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere il tessuto in un tampone contenente l'inibitore e la DNasi e dissociarlo meccanicamente per formare una sospensione unicellulare.

Sovrapporre la sospensione su una soluzione tampone contenente proteine.

Centrifugare ed eliminare il surnatante contenente detriti cellulari.

Risospendere le cellule in terreno e seminarle su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina per facilitare l'adesione cellulare.

Rimuovere il supporto. Lavare le cellule con terreno fresco, quindi aggiungere un terreno contenente un inibitore del ciclo cellulare per prevenire la proliferazione delle cellule gliali.

Sostituire metà del terreno con un terreno nuovo contenente un inibitore del lisosoma.