Rimozione selettiva della microglia da una coltura di neuroni di granuli cerebellari di ratto

Prendi un cervelletto di ratto raccolto e taglialo in frammenti.

Trasferire i frammenti in una provetta contenente tripsina e incubare.

tripsina digerisce la matrice extracellulare del tessuto, allentando i neuroni dei granuli cerebellari, così come le cellule non neuronali come la microglia e gli astrociti.

Aggiungere un tampone contenente un inibitore della tripsina e la DNasi. L'inibitore inattiva la tripsina mentre la DNasi degrada il DNA contaminante.

Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere il tessuto in un tampone contenente l'inibitore e la DNasi e dissociarlo meccanicamente per formare una sospensione unicellulare.

Sovrapporre la sospensione su una soluzione tampone contenente proteine.

Centrifugare ed eliminare il surnatante contenente detriti cellulari.

Risospendere le cellule in terreno e seminarle su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina per facilitare l'adesione cellulare.

Rimuovere il supporto. Lavare le cellule con terreno fresco, quindi aggiungere un terreno contenente un inibitore del ciclo cellulare per prevenire la proliferazione delle cellule gliali.

Sostituire metà del terreno con un terreno nuovo contenente un inibitore del lisosoma.

L'inibitore prende di mira selettivamente la microglia e interrompe le membrane lisosomiali, causando la morte della microglia e la rimozione dalla coltura.

Inizia questa procedura raccogliendo il cervelletto da cuccioli di ratto di quattro a sette giorni. Metterli immediatamente in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di soluzione A con ghiaccio. Quindi, rimuovere la soluzione in eccesso dal cervelletto e posizionare il fazzoletto nel coperchio della capsula di Petri. Quindi, trita finemente il fazzoletto con una lama di rasoio ben fiammata in almeno tre direzioni diverse.

Successivamente, aggiungere il fazzoletto tritato alla soluzione B. Metterlo a bagnomaria a 37 gradi Celsius per cinque minuti e agitarlo delicatamente ogni due minuti. Quindi, aggiungere 20 millilitri di soluzione D al tubo per neutralizzare la tripsina. Agitare e centrifugare a 65 g per cinque minuti. Successivamente, versare il surnatante. Risospenderlo in quattro millilitri di soluzione C.

Triturare il campione 10 volte con ciascuna delle tre pipette di vetro fiammato di diametro decrescente fino a quando la sospensione è il più omogenea possibile. Quindi, aggiungere lentamente e delicatamente alcune gocce di questo omogeneizzato sopra il BSA-EBSS. Se inizia ad affondare attraverso il BSA-EBSS, triturare di più e aggiungere un po' più di soluzione C. L'omogeneizzato dovrebbe essere posizionato in uno strato sopra il BSA-EBSS.

Centrifugare a 100 g per cinque minuti e non agitare. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno MEM. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastrerle a 800.000 cellule per vetrino coprioggetti in 500 microlitri di terreno MEM. Dopodiché, mettili in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 6% di anidride carbonica. Quindi, preparare una soluzione di terreno MEM contenente 10 micromolari dell'inibitore del ciclo cellulare, AraC.

Per ogni vetrino coprioggetti, conservare 250 microlitri del vecchio terreno in una piastra fresca a 24 pozzetti e aspirare il resto. Aggiungere 250 microlitri di terreno MEM normale per lavare le cellule. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di terreno vecchio alle cellule e rabboccare con 250 microlitri di terreno contenente AraC.

In questa procedura, aggiungere LME puro a cinque millilitri di terreno MEM per ottenere una concentrazione finale di 150 millimolari di LME. Riportare la soluzione a pH 7,4 utilizzando una soluzione acido-base. Quindi, filtrarlo in modo sterile utilizzando un PES da 28 millimetri con filtro per siringa da 0,2 micrometri.

Successivamente, diluire la soluzione LME a una concentrazione di 50 millimolari in terreno MEM. Quindi, metterlo a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 10 minuti, insieme al normale terreno MEM per colture di controllo. Dopo 10 minuti, rimuovere 250 microlitri di terreno MEM da ciascuna coltura CGC. Quindi, conservare il supporto a 37 gradi Celsius.

Successivamente, trattare le cellule con terreno MEM contenente due volte LME o con terreno MEM preriscaldato senza LME per colture di controllo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 6% di anidride carbonica per un'ora. Successivamente, lavare le cellule due volte in un terreno MEM fresco e preriscaldato per rimuovere il terreno contenente LME.

Quindi, sostituire il terreno di coltura trattenuto con una quantità uguale di terreno MEM fresco e preriscaldato. Infine, incubare le colture in anidride carbonica umidificata al 6% a 37 gradi Celsius.