DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un'impronta digitale del DNA distintiva del mycobacterium lere, il batterio non coltivabile che causa la lebbra direttamente da campioni clinici. Il DNA batterico estratto dalle biopsie dei pazienti viene amplificato mediante una PCR multiplex utilizzando primer fluorescenti specifici per i loci a numero variabile di ripetizioni tandem o VNTR. Una volta che il DNA è stato amplificato, viene eseguita l'elettroforesi capillare per l'analisi della lunghezza del frammento.

I dati vengono analizzati per determinare il numero di brevi segmenti di DNA ripetuti in tandem in ciascun locus. Perché diversi ceppi di EPRI mostrano un numero diverso di ripetizioni tandem in ciascun locus. I dati provenienti da più loci producono impronte digitali del DNA univoche e con questa tecnica è possibile generare un database dei tipi di ceppo del paziente.

La struttura della popolazione, l'evoluzione e la trasmissione della lebbra tra i pazienti in comunità definite e in tutto il mondo possono essere caratterizzate, fornendo in ultima analisi strumenti genetici e prove per l'eliminazione della lebbra. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la diffusione della lebbra, per identificare cluster di infezioni recenti e individui a rischio e per misurare l'efficacia di programmi controllati. A dimostrare la procedura saranno noi Lee e Ron Jensen, ricercatori del mio laboratorio e Jason Rivers del nostro strumento principale Extract, DNA da biopsie cliniche utilizzando un kit standard di estrazione del DNA KaiGen.

Una volta ottenuto il DNA, allestire una nuova area di lavoro all'interno di una cabina PCR pulita. Per evitare qualsiasi contaminazione del DNA, pulire l'armadio e un set di pipette con etanolo al 70% e sottoporre l'armadio e le pipette alla luce UV per 15 minuti. Una volta pulito l'armadio, la PCR multiplex può essere impostata per ogni PCR multiplex da quattro a cinque coppie di primer in cui un primer per coppia è marcato in fluorescenza.

Deve essere miscelato. Utilizzare 10 stock di primer micromolari preparati nel tampone per fare in modo che le miscele di primer mescolino quantità uguali di tutti i primer anteriori o superiori in un tubo einor in modo da ottenere una concentrazione finale di due micromolari. Per ogni primer, aggiungere un tampone TE se necessario.

In un altro einor mescolare tutti i primer inversi o inferiori allo stesso modo. Una volta realizzate le miscele di base, preparare la miscela PCR MES. Creare una mappa delle piastre etichettata con tutti i campioni e i controlli per campione.

La miscela master deve contenere 12 microlitri di miscela KaiGen multiplex PCR, due microlitri di ciascun pool di primer e due microlitri di soluzione Q. Assicurarsi di preparare una quantità sufficiente di master mix per includere i controlli e tenere conto delle perdite di pipettaggio. Centrifugare brevemente la miscela master.

Successivamente, aliquotare 18 microlitri di master mix in ciascun pozzetto di una piastra PCR. Per evitare di contaminare i campioni di DNA, cambiare i guanti, pulire e disinfettare una cabina di biosicurezza separata. Come in precedenza, una volta decontaminata la cappa, trasferire la piastra su quella cappa.

Quindi aggiungere due microlitri di campione di DNA a ciascun pozzetto contenente la miscela master. Assicurarsi di utilizzare i puntali delle pipette per la prevenzione degli aerosol per evitare la contaminazione incrociata. Sigillare accuratamente le piastre PCR e centrifusion brevemente per miscelare il contenuto.

Quindi posizionare la piastra di reazione nel termociclatore e avviare il programma PCR per l'invio dei campioni. Per la FLA, preparare la forma ammide size, master mix e aggiungere prodotti PCR diluiti in una provetta einor pulita combinata con 12 microlitri di soluzione ad alto contenuto di dfor ammide e 0,3 microlitri di scansione genica, 500 standard di dimensionamento del coperchio per campione da testare. Aliquotare 12,3 microlitri di questa soluzione per pozzetto in una piastra di reazione di qualità ottica a 96 pozzetti.

Una volta completata la PCR, la piastra viene centrifugata. Assicurarsi che la posizione di ciascun campione sia registrata sulla mappa della targa. Quindi, in una piastra separata da 96 pozzetti, aliquotare 59 microlitri di acqua priva di nucleasi per pozzetto e aggiungere un microlitro di ciascuna reazione PCR per pozzetto per diluire il DNA amplificato da uno a 60.

Una volta diluito il DNA, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire un microlitro di ciascun campione di PCR diluito nel pozzetto corrispondente della piastra contenente la soluzione sciolta di forma ammide. Una volta completato il programma, i campioni possono essere testati mediante elettroforesi su gel agros standard per confermare che i frammenti di DNA delle dimensioni previste sono stati amplificati a questo punto. I campioni vengono preparati per l'analisi mediante elettroforesi capillare fluorescente utilizzando un analizzatore genetico FLA prima dell'analisi, aggiungono un setto alla piastra e centrifugano brevemente per rimuovere le bolle d'aria e far cadere il campione nel pozzetto.

L'IDE per denaturare chimicamente i filamenti, quindi non è necessario denaturare a caldo. Posizionare la piastra in un vassoio di caricamento. Valutare il prodotto PCR etichettato utilizzando l'elettroforesi capillare come l'analizzatore genetico ABBI 31 30 xl.

Analizzare i campioni utilizzando un capillare di 50 centimetri riempito con polimero pop seven come mezzo di separazione. Il DNA migra verso la fine del capillare, dove un laser e un rivelatore misurano le etichette fluorescenti aprendo il software di raccolta dell'analizzatore. L'analizzatore dovrà essere calibrato per rilevare tutti i coloranti utilizzati prima di eseguire i campioni, compreso lo standard dimensionale il dset utilizzato per questi campioni è ABI G cinque campioni di dissezione vengono iniettati elettrocineticamente a 1,6 kilovolt per 15 secondi.

Separare i frammenti applicando 15 kilovolt per 1800 secondi. L'autonomia totale per ogni corsa è di circa 45 minuti. Al termine dell'esecuzione, creare file di dati per ogni campione.

I file vengono inseriti in una cartella per piastre dal software di raccolta dell'analizzatore in una posizione predeterminata. I file sono in formato FSA. I dati FLA possono essere analizzati utilizzando il software di scansione dei picchi, disponibile gratuitamente sul sito Web di Applied Biosystems.

Per analizzare i dati, fare clic su avvia nuovo progetto, quindi su aggiungi file. Caricare i file di dati selezionati nel programma, compresi i controlli positivi e negativi. Seleziona e analizza i file caricati.

I risultati vengono tracciati come cromatogramma FLA. Gli standard di dimensionamento appaiono come picchi arancioni, mentre i picchi colorati rappresentano i candidati DNA batterico per ogni locus analizzato nel campione, fare clic su un picco per determinare la dimensione della sua coppia di basi. A causa della sintesi del filamento di scorrimento della DNA polimerasi, una famiglia di picchi dello stesso colore sarà rilevata per alcuni loci microsatelliti.

In questi casi, il picco selezionato è solitamente quello di maggiore ampiezza. Confrontare le dimensioni dei frammenti in ciascun campione con le dimensioni del controllo positivo per determinare quanti segmenti di ripetizione tandem sono presenti per ogni birra testata e registrare i dati in un foglio di calcolo Excel per ulteriori analisi. In questa figura viene mostrata l'impronta digitale del DNA di isolati di sette pazienti appartenenti a tre diverse famiglie dello stesso villaggio ed è indicato il numero di ripetizioni tandem per ogni locus polimorfico analizzato.

Questi dati suggeriscono che due membri della famiglia sono infettati dallo stesso ceppo, mentre un membro è infettato da un ceppo distinto. I membri della famiglia C sono probabilmente infettati dallo stesso ceppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come includere regolarmente la PCR multiplex e l'analisi della lunghezza dei frammenti per ottenere le impronte digitali V-N-T-R-D-N-A per i pazienti affetti da lebbra che si presentano nelle cliniche.

Si tratta di nuovi strumenti molecolari per integrare l'epidemiologia convenzionale per il controllo della malattia da lebbra.