Name: DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri il DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae tramite analisi VNTR e elettroforesi capillare per tracciare la trasmissione della lebbra. Questo metodo genetico supporta gli interventi di sanità pubblica per l'eliminazione della malattia.

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Il finanziamento è stato fornito dal NIH / NIAID concedere RO1-AI-63457 e ARRA concedere supplemento RO1-AI-63457 S1. Riconosciamo il contributo di tutti i membri attuali e passati del gruppo di laboratorio e collaboratori.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La raccolta di campioni di pelle di malati di lebbra richiede medici specializzati o tecnici che lavorano nelle cliniche della pelle. Personale di laboratorio maneggiare questi campioni devono prestare particolare attenzione ad indossare camici, guanti e occhiali protettivi e di lavorare in un bio-sicurezza gabinetto durante la manipolazione di campioni di tessuti umani infetti o armadillo. Disinfezione delle superfici e degli strumenti è anche critico. Lavorare in un ambiente pulito, sterile bio-safe mobile è importante per evitare la contaminazione dei campioni di DNA. L&#39;estrazione del DNA è diventato relativamente facile grazie allo sviluppo di kit di estrazione da aziende come Qiagen. Indicazioni devono essere seguite attentamente. Tutti i campioni devono essere conservati al freddo, quando non in uso. Evitare il ripetersi, sbalzi di temperatura per i campioni. Primer DNA usato in questo lavoro può essere ordinato presso diverse aziende che sono state citate nella lista dei riferimenti bibliografici alla fine di questo documento. Si deve prestare attenzione a lavorare con primer in un ambiente DNA libero al fine di evitare la contaminazione. Primer vengono come polvere e deve essere miscelato con TE e diluito ad una concentrazione 100μM, poi separati in piccole quantità (Figura 2a). Soluzioni di lavoro di primer sono ulteriormente diluito a concentrazioni 10μM. Anche in questo caso, non utilizzare campioni di DNA in aree / cappe in cui vengono utilizzati primer e preparati. I prodotti di PCR devono essere conservati al freddo, quando non in uso. Un 3% di agarosio preparazione gel darà una migliore separazione banda del DNA, ma richiede più tempo per l&#39;esecuzione. Per scopi puramente qualitativi, 2% è solitamente sufficiente. Soluzione di bromuro di etidio utilizzato per la colorazione del DNA in gel di agarosio è un genotoxin altamente attivo che viene assorbito attraverso la pelle. Gestire questa soluzione e gel colorati con essa utilizzando grande attenzione e sempre con la certezza di indossare i guanti. Lavarsi accuratamente le mani dopo aver toccato qualsiasi DNA campioni o materiali di bromuro di etidio. Smaltire soluzione colorante etidio bromuro, lavare e gel secondo le linee guida istituzionali. Gel non sono normalmente necessarie; questo passo può essere eliminata una volta metodi FLA sono state stabilite. E &#39;tempo e consumare reagenti. La soluzione formamide utilizzati nella preparazione dei campioni per la FLA è anche altamente tossico e deve essere maneggiato con cura. Lavarsi le mani dopo l&#39;uso. Disporre di esso le linee guida istituzionali. Lettura dei risultati di FLA utilizzando il software di picco Scanner può essere impegnativo. Un insieme di base delle chiamate allele (numero di ripetizioni in tandem) è stato sviluppato a CSU (Tabelle 4-7). (Va notato che le tabelle 4-7 non può essere tutto compreso. Come altri ceppi di M. leprae sono studiati, alleli con numero di copie di fuori degli intervalli elencati possono essere trovati.) Una sfida particolare consiste &#39;balbettare&#39; picchi. Si tratta di famiglie di picchi, in particolare di segnalazioni di operazioni sospette che coinvolgono solo 2-3 ripete coppia di basi, come ad esempio (TA) 10. Volte la scelta della punta giusta per leggere è difficile (Figura 7). In questa figura, il picco nel controllo positivo a 190 bp è la vetta principale. Picchi inferiori in altezza che sono 2, 4 o anche 6 coppie di basi più grande o più piccola della vetta principale si chiamano &#39;picchi balbettare.&#39; A-tailing può anche causare confusione. A-tailing è descritto in precedenza nel testo e nella Figura 8. Infine, se i prodotti di PCR sono molto abbondanti nei campioni, i picchi possono apparire con un picco doppio. In questo caso, leggere il centro della forma di picco. (Vedi Figura 6, paziente 6.) La gestione dei dati può essere un compito arduo per questo tipo di lavoro. E &#39;importante registrare tutte le informazioni pertinenti per tutti gli esperimenti, quali: data di un compito o di procedura, l&#39;operatore, striscia / piastra mappe, ordini FLA, condizioni di PCR e le ricette, le date di gel e fotografie, temperature di conservazione, diluizioni modello di DNA, FLA percorsi di memorizzazione di file elettronici, organizzazione ecc Buono e gestione dei dati consente di risparmiare ore di tempo dedicato alla ricerca di informazioni specifiche per il futuro. Il lavoro di laboratorio qui descritta è andata avanti per diversi anni presso la Colorado State University e in altri luoghi in tutto il mondo. L&#39;immagine grande di quello che tutti i dati raccolti mezzi e come può essere di uso futuro sta iniziando ad emergere. Figure 10A e 10B dimostrare come questi le impronte digitali del DNA può essere utilizzato per distinguere differenti M. leprae tensioni tra paesi (10A) o anche tra le famiglie (10B). In materia di famiglia e di comunità collegate hanno dimostrato di portare M. leprae di tipo VNTR simili o identici ceppo. La speranza è che possa essere possibile ottenere una visione più completa la modalità (s) di trasmissione di lebbra in modo che un sistema di individuazione precoce delle reti di trasmissione possono essere sviluppate per quelle persone most a rischio, e che la terapia farmacologica curativa può iniziare prima di danni neurologici permanenti e dermatologici è fatto.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Sangue DNeasy e Kit Tissue </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA primer </td><td> Vari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel di agarosio </td><td> Vari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x o 6x Gel Loading Buffer </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Ricette a disposizione per rendere il vostro proprio * </td></tr><tr><td> Bromuro di etidio soluzione </td><td> Vari </td><td></td><td> Diluire da truffa. </td></tr><tr><td> Hi-Di Formammide Solution </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 2 frigoriferi </td><td> 4 ° C: 1 per i campioni di DNA, 1 per primer e reagenti Multiplex </td></tr><tr><td> 1 forno a microonde </td><td> O modo adatto per il riscaldamento agarosio e acqua per fare gel </td></tr><tr><td> 1 autoclave </td><td> O pentola a pressione per la sterilizzazione dei materiali </td></tr><tr><td> PCR macchina </td><td> Termociclatore </td></tr><tr><td> 2 set di pipette </td><td> 0,5-10 microlitri, 10-100 microlitri, 20-200 microlitri, 1000 ml 1 set per primer, 1 set di DNA </td></tr><tr><td> Sottomarino gel elettroforesi scatola </td><td> Con forme e pettini per la preparazione gel. </td></tr><tr><td> Elettroforesi alimentazione </td><td> Con cavi per il collegamento alla casella gel </td></tr><tr><td> Calore blocco </td><td> Per tubi Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Per tubi Eppendorf / strisce </td></tr><tr><td> Sistema di elettroforesi capillare (analisi genetiche) </td><td> O l&#39;accesso a un istituto in grado di eseguire questa analisi </td></tr><tr><td> Plastica </td><td> Aerosol monouso puntali, provette Eppendorf, strisce da 8 pozzetti, piastre a 96 pozzetti, alcune delle qualità ottica </td></tr><tr><td> Computer con collegamento Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting di mycobacterium leprae ceppi utilizzando variabile tandem repeat number (vntr) - lunghezza analisi fragment (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Lo studio della trasmissione della lebbra è particolarmente difficile dato che l&#39;agente eziologico, Mycobacterium leprae, non può essere coltivato in laboratorio. Le uniche fonti dei batteri sono malati di lebbra, e armadilli sperimentalmente infetti e topi nudi. Così, molti dei metodi utilizzati in epidemiologia moderna non sono disponibili per lo studio della lebbra. Nonostante un ampio programma globale di trattamento farmacologico per la lebbra attuato dalla WHO 1, la lebbra rimane endemica in molti paesi con circa 250.000 nuovi casi ogni anno. 2 L&#39;intera M. leprae genoma è stata mappata 3,4 e molti loci sono stati identificati che si sono ripetuti segmenti di 2 o più paia di basi (chiamate micro-e minisatelliti). 5 ceppi clinici di M. leprae possono variare nel numero di segmenti ripetuti in tandem (ripetizioni in tandem corto, STR) a molti di questi loci. 5,6,7 numero variabile di ripetizione in tandem (VNTR) 5 analisi è stato utilizzato per distinguere i diversi ceppi di bacilli della lebbra. Alcuni dei loci sembrano essere più stabili di altri, mostrando meno variazioni di numeri si ripetono, mentre altri sembrano cambiare più rapidamente, a volte nello stesso paziente. Mentre la variabilità di alcuni VNTRs ha portato fino domande riguardanti la loro idoneità per la tipizzazione ceppo 7,8,9, i dati emersi suggeriscono che loci multipli, che sono diversi nella loro stabilità, può essere utilizzato come un valido strumento epidemiologico. Multiple locus VNTR analisi (MLVA) 10 è stato usato per studiare l&#39;evoluzione lebbra e la trasmissione in diversi paesi tra cui Cina 11,12, Malawi 8, le Filippine 10,13, e in Brasile 14. MLVA prevede più passaggi. In primo luogo, DNA batterico viene estratto insieme al DNA tessuto ospite da biopsie clinici o macchie della pelle fessura (SSS). 10 I loci desiderati sono poi amplificati dal DNA estratto tramite reazione a catena della polimerasi (PCR). Primers marcati con fluorescenza per 4-5 loci diversi sono usati per reazione, con 18 loci essere amplificato in un totale di quattro reazioni. 10 I prodotti di PCR può essere sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio per verificare la presenza di segmenti di DNA desiderato, quindi sottoposti ad analisi a fluorescenza della lunghezza dei frammenti (FLA) usando elettroforesi capillare. DNA da batteri armadillo diversi passaggi con un numero definito di copie ripetere per ogni locus viene utilizzato come controllo positivo. I cromatogrammi FLA vengono poi esaminati usando il software dello scanner e di picco della lunghezza dei frammenti viene convertito in numero di copie VNTR (allele). Infine, gli aplotipi VNTR sono analizzati per i modelli, e se combinata con i dati clinici del paziente possono essere utilizzati per monitorare la distribuzione dei tipi di deformazione.

La lebbra, causata da<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, È ancora endemica in molti luoghi. Al fine di conoscere la diffusione e la modalità di trasmissione della lebbra, è importante per determinare quale ceppo di<em&gt; M. leprae</em&gt; Ha infettato un paziente. Un numero variabile di ripetizioni tandem (VNTR) digitazione è uno di questi metodi.

DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA)

Lo studio della trasmissione della lebbra è particolarmente difficile poiché l'agente eziologico, Mycobacterium leprae, non può essere coltivato in laboratorio.

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un profilo di DNA distintivo di *Mycobacterium leprae*, il batterio non coltivabile che causa la lebbra, direttamente da campioni clinici. Il DNA batterico di *M. leprae*, estratto da biopsie del paziente, viene amplificato mediante PCR multiplex utilizzando primer fluorescenti specifici per i loci a ripetizione in tandem a numero variabile, o VNTR. Una volta amplificato il DNA, viene eseguita un'analisi di lunghezza dei frammenti mediante elettroforesi capillare.I dati vengono analizzati per determinare il numero di segmenti di DNA con ripetizioni tandem corte in ciascun locus. Poiché ceppi diversi di EPRI presentano un numero differente di ripetizioni tandem in ogni locus, i dati ottenuti da più loci producono impronte genetiche uniche e può essere generato un database dei tipi di ceppo del paziente utilizzando questa tecnica.La struttura della popolazione, l'evoluzione e la trasmissione della lebbra tra pazienti in comunità definite e a livello globale possono essere caratterizzate, fornendo infine strumenti genetici e prove a sostegno dell'eliminazione della lebbra. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la diffusione della lebbra, identificare aggregati di infezioni recenti e individui a rischio, nonché misurare l'efficacia di programmi controllati. A dimostrazione della procedura saranno presenti Lee e Ron Jensen, ricercatori del mio laboratorio, e Jason Rivers del nostro centro di strumentazione. Estrarre il DNA da biopsie cliniche utilizzando un kit standard di estrazione del DNA KaiGen.Una volta ottenuto il DNA, preparare una nuova area di lavoro all'interno di un armadio PCR pulito. Per evitare contaminazioni di DNA, pulire l'armadio e un set di pipette con etanolo al 70% ed esporre l'armadio e le pipette alla luce UV per 15 minuti. Una volta che l'armadio è pulito, si può allestire la reazione di PCR multiplex; per ogni PCR multiplex utilizzare quattro o cinque coppie di primer, in cui un primer per coppia è marcato fluorescentemente.Deve essere miscelato. Utilizzare stock di primer a 10 micromolari preparati in tampone TE per preparare le miscele di primer, mescolando quantità uguali di tutti i primer forward o superiori in un tubo Eppendorf in modo da ottenere una concentrazione finale di 2 micromolari. Per ogni primer, aggiungere tampone TE se necessario.In un altro tubo, mescolare tutti i primer inversi o inferiori nello stesso modo. Una volta preparate le miscele di primer, preparare la miscela PCR MES. Creare una mappa della piastra etichettata con tutti i campioni e i controlli per ogni campione.La miscela master deve contenere 12 microlitri di miscela PCR multiplex KaiGen, due microlitri di ciascun pool di primer e due microlitri di soluzione Q. Assicurarsi di preparare una quantità sufficiente di miscela master per includere i controlli e compensare le perdite durante la pipettaggio. Centrifugare brevemente la miscela master.Successivamente, aliquotare 18 microlitri di mix master in ogni pozzetto di una piastra per PCR. Per evitare la contaminazione dei campioni di DNA, cambiare i guanti, pulire e disinfettare un armadio a sicurezza biologica separato. Come in precedenza, una volta che la cappa è stata decontaminata, trasferire la piastra in tale cappa.Quindi aggiungere due microlitri di campione di DNA in ogni pozzetto contenente la miscela maestra. Assicurarsi di utilizzare punte per pipetta con protezione contro gli aerosol per evitare contaminazioni incrociate. Sigillare con cura le piastre PCR e centrifugare brevemente per mescolare il contenuto.Quindi posizionare la piastra di reazione nel termociclatore e avviare il programma PCR per l'invio dei campioni. Per FLA, preparare la dimensione in formammide, il master mix e aggiungere i prodotti PCR diluiti in una provetta einor pulita combinando 12 microlitri di soluzione di formammide ad alta purezza e 0,3 microlitri di gene scan, 500 lid sizing standard per ogni campione da testare. Aliquotare 12,3 microlitri di questa soluzione per pozzetto in una piastra di reazione ottica da 96 pozzetti.Al termine della PCR, la piastra viene centrifugata. Assicurarsi che la posizione di ogni campione sia registrata sulla mappa della piastra. Successivamente, in una piastra separata da 96 pozzetti, aliquotare 59 microlitri di acqua priva di nucleasi per pozzetto e aggiungere un microlitro di ogni reazione PCR per pozzetto, per diluire il DNA amplificato in un rapporto di 1 a 60.Dopo aver diluito il DNA, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire un microlitro di ciascun campione PCR diluito nel pozzetto corrispondente della piastra contenente la soluzione libera di formammide. Al termine del programma, i campioni possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio standard per verificare che a questo punto siano stati amplificati frammenti di DNA delle dimensioni previste. I campioni vengono preparati per l'analisi mediante elettroforesi capillare fluorescente utilizzando un analizzatore genetico FLA; prima dell'analisi, aggiungere un setto alla piastra e centrifugare brevemente per rimuovere le bolle d'aria e far scendere il campione nel pozzetto.L'IDE chimicamente denatura i filamenti, quindi non è necessario effettuare la denaturazione termica. Posizionare la piastra in un vassoio di caricamento. Valutare il prodotto PCR marcato mediante elettroforesi capillare, ad esempio utilizzando l'analizzatore genetico ABBI'S 3130 xl.Analizzare i campioni utilizzando un capillare da 50 centimetri riempito con il polimero pop seven come mezzo di separazione. Il DNA migra verso l'estremità del capillare, dove un laser e un rivelatore misurano le etichette fluorescenti; aprire il software di acquisizione dell'analizzatore. Prima dell'esecuzione dei campioni, l'analizzatore dovrà essere calibrato per rilevare tutti i coloranti utilizzati, inclusi gli standard di dimensione; il dset impiegato per questi campioni è ABIs G five. I campioni vengono iniettati per via elettocinetica a 1,6 chilovolt per 15 secondi.Separare i frammenti applicando 15 kilovolts per 1800 secondi. La durata totale di ogni corsa è di circa 45 minuti. Al termine della corsa, creare file di dati per ogni campione.I file vengono posizionati in una cartella della piastra dal software di acquisizione dell'analizzatore in un percorso predeterminato. I file sono in formato FSA. I dati FLA possono essere analizzati utilizzando il software peak scanner, disponibile gratuitamente sul sito web di Applied Biosystems.Per analizzare i dati, fare clic su "inizia nuovo progetto", seguito da "aggiungi file". Caricare i file di dati selezionati nel programma, inclusi i controlli positivi e negativi. Selezionare e analizzare i file caricati.I risultati sono riportati come cromatogramma FLA. Gli standard di dimensione compaiono come picchi arancioni, mentre i picchi colorati rappresentano i campioni di DNA batterico per ciascun locus analizzato nel campione; fare clic su un picco per determinarne la dimensione in paia di basi. A causa della sintesi con slittamento del filamento da parte della DNA polimerasi, per alcuni loci microsatelliti verrà rilevata una famiglia di picchi dello stesso colore.In questi casi, il picco selezionato è solitamente quello con l'ampiezza maggiore. Confrontare le dimensioni dei frammenti in ogni campione con quella del controllo positivo per determinare quanti segmenti di ripetizioni in tandem sono presenti per ciascun allele analizzato e registrare i dati in un foglio di calcolo Excel per ulteriori analisi. In questa figura, sono mostrati i profili di DNA di isolati provenienti da sette pazienti appartenenti a tre famiglie diverse dello stesso villaggio e viene indicato il numero di ripetizioni in tandem per ciascun locus polimorfico analizzato.Questi dati indicano che due membri della famiglia B sono infettati dallo stesso ceppo, mentre un membro è infettato da un ceppo distinto. I membri delle famiglie C sono probabilmente infettati dallo stesso ceppo. Come pure i membri della famiglia A. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come includere abitualmente la PCR multiplex e l'analisi della lunghezza dei frammenti per ottenere profili di DNA VNTR per i pazienti affetti da lebbra che si presentano in ambulatorio.Questi sono strumenti molecolari innovativi per integrare l'epidemiologia convenzionale nel controllo della lebbra.

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Scopri il DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae tramite analisi VNTR e elettroforesi capillare per tracciare la trasmissione della lebbra. Questo metodo genetico supporta gli interventi di sanità pubblica per l'eliminazione della malattia.

DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA) (Video) | JoVE Journal

DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA)

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