DNA fingerprinting di Mycobacterium leprae Ceppi Utilizzando variabile Tandem Repeat Number (VNTR) - Lunghezza Analisi Fragment (FLA)

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un profilo di DNA distintivo di *Mycobacterium leprae*, il batterio non coltivabile che causa la lebbra, direttamente da campioni clinici. Il DNA batterico di *M. leprae*, estratto da biopsie del paziente, viene amplificato mediante PCR multiplex utilizzando primer fluorescenti specifici per i loci a ripetizione in tandem a numero variabile, o VNTR. Una volta amplificato il DNA, viene eseguita un'analisi di lunghezza dei frammenti mediante elettroforesi capillare.

I dati vengono analizzati per determinare il numero di segmenti di DNA con ripetizioni tandem corte in ciascun locus. Poiché ceppi diversi di EPRI presentano un numero differente di ripetizioni tandem in ogni locus, i dati ottenuti da più loci producono impronte genetiche uniche e può essere generato un database dei tipi di ceppo del paziente utilizzando questa tecnica.

La struttura della popolazione, l'evoluzione e la trasmissione della lebbra tra pazienti in comunità definite e a livello globale possono essere caratterizzate, fornendo infine strumenti genetici e prove a sostegno dell'eliminazione della lebbra. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la diffusione della lebbra, identificare aggregati di infezioni recenti e individui a rischio, nonché misurare l'efficacia di programmi controllati. A dimostrazione della procedura saranno presenti Lee e Ron Jensen, ricercatori del mio laboratorio, e Jason Rivers del nostro centro di strumentazione. Estrarre il DNA da biopsie cliniche utilizzando un kit standard di estrazione del DNA KaiGen.

Una volta ottenuto il DNA, preparare una nuova area di lavoro all'interno di un armadio PCR pulito. Per evitare contaminazioni di DNA, pulire l'armadio e un set di pipette con etanolo al 70% ed esporre l'armadio e le pipette alla luce UV per 15 minuti. Una volta che l'armadio è pulito, si può allestire la reazione di PCR multiplex; per ogni PCR multiplex utilizzare quattro o cinque coppie di primer, in cui un primer per coppia è marcato fluorescentemente.

Deve essere miscelato. Utilizzare stock di primer a 10 micromolari preparati in tampone TE per preparare le miscele di primer, mescolando quantità uguali di tutti i primer forward o superiori in un tubo Eppendorf in modo da ottenere una concentrazione finale di 2 micromolari. Per ogni primer, aggiungere tampone TE se necessario.

In un altro tubo, mescolare tutti i primer inversi o inferiori nello stesso modo. Una volta preparate le miscele di primer, preparare la miscela PCR MES. Creare una mappa della piastra etichettata con tutti i campioni e i controlli per ogni campione.

La miscela master deve contenere 12 microlitri di miscela PCR multiplex KaiGen, due microlitri di ciascun pool di primer e due microlitri di soluzione Q. Assicurarsi di preparare una quantità sufficiente di miscela master per includere i controlli e compensare le perdite durante la pipettaggio. Centrifugare brevemente la miscela master.

Successivamente, aliquotare 18 microlitri di mix master in ogni pozzetto di una piastra per PCR. Per evitare la contaminazione dei campioni di DNA, cambiare i guanti, pulire e disinfettare un armadio a sicurezza biologica separato. Come in precedenza, una volta che la cappa è stata decontaminata, trasferire la piastra in tale cappa.

Quindi aggiungere due microlitri di campione di DNA in ogni pozzetto contenente la miscela maestra. Assicurarsi di utilizzare punte per pipetta con protezione contro gli aerosol per evitare contaminazioni incrociate. Sigillare con cura le piastre PCR e centrifugare brevemente per mescolare il contenuto.

Quindi posizionare la piastra di reazione nel termociclatore e avviare il programma PCR per l'invio dei campioni. Per FLA, preparare la dimensione in formammide, il master mix e aggiungere i prodotti PCR diluiti in una provetta einor pulita combinando 12 microlitri di soluzione di formammide ad alta purezza e 0,3 microlitri di gene scan, 500 lid sizing standard per ogni campione da testare. Aliquotare 12,3 microlitri di questa soluzione per pozzetto in una piastra di reazione ottica da 96 pozzetti.

Al termine della PCR, la piastra viene centrifugata. Assicurarsi che la posizione di ogni campione sia registrata sulla mappa della piastra. Successivamente, in una piastra separata da 96 pozzetti, aliquotare 59 microlitri di acqua priva di nucleasi per pozzetto e aggiungere un microlitro di ogni reazione PCR per pozzetto, per diluire il DNA amplificato in un rapporto di 1 a 60.

Dopo aver diluito il DNA, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire un microlitro di ciascun campione PCR diluito nel pozzetto corrispondente della piastra contenente la soluzione libera di formammide. Al termine del programma, i campioni possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio standard per verificare che a questo punto siano stati amplificati frammenti di DNA delle dimensioni previste. I campioni vengono preparati per l'analisi mediante elettroforesi capillare fluorescente utilizzando un analizzatore genetico FLA; prima dell'analisi, aggiungere un setto alla piastra e centrifugare brevemente per rimuovere le bolle d'aria e far scendere il campione nel pozzetto.

L'IDE chimicamente denatura i filamenti, quindi non è necessario effettuare la denaturazione termica. Posizionare la piastra in un vassoio di caricamento. Valutare il prodotto PCR marcato mediante elettroforesi capillare, ad esempio utilizzando l'analizzatore genetico ABBI'S 3130 xl.

Analizzare i campioni utilizzando un capillare da 50 centimetri riempito con il polimero pop seven come mezzo di separazione. Il DNA migra verso l'estremità del capillare, dove un laser e un rivelatore misurano le etichette fluorescenti; aprire il software di acquisizione dell'analizzatore. Prima dell'esecuzione dei campioni, l'analizzatore dovrà essere calibrato per rilevare tutti i coloranti utilizzati, inclusi gli standard di dimensione; il dset impiegato per questi campioni è ABIs G five. I campioni vengono iniettati per via elettocinetica a 1,6 chilovolt per 15 secondi.

Separare i frammenti applicando 15 kilovolts per 1800 secondi. La durata totale di ogni corsa è di circa 45 minuti. Al termine della corsa, creare file di dati per ogni campione.

I file vengono posizionati in una cartella della piastra dal software di acquisizione dell'analizzatore in un percorso predeterminato. I file sono in formato FSA. I dati FLA possono essere analizzati utilizzando il software peak scanner, disponibile gratuitamente sul sito web di Applied Biosystems.

Per analizzare i dati, fare clic su "inizia nuovo progetto", seguito da "aggiungi file". Caricare i file di dati selezionati nel programma, inclusi i controlli positivi e negativi. Selezionare e analizzare i file caricati.

I risultati sono riportati come cromatogramma FLA. Gli standard di dimensione compaiono come picchi arancioni, mentre i picchi colorati rappresentano i campioni di DNA batterico per ciascun locus analizzato nel campione; fare clic su un picco per determinarne la dimensione in paia di basi. A causa della sintesi con slittamento del filamento da parte della DNA polimerasi, per alcuni loci microsatelliti verrà rilevata una famiglia di picchi dello stesso colore.

In questi casi, il picco selezionato è solitamente quello con l'ampiezza maggiore. Confrontare le dimensioni dei frammenti in ogni campione con quella del controllo positivo per determinare quanti segmenti di ripetizioni in tandem sono presenti per ciascun allele analizzato e registrare i dati in un foglio di calcolo Excel per ulteriori analisi. In questa figura, sono mostrati i profili di DNA di isolati provenienti da sette pazienti appartenenti a tre famiglie diverse dello stesso villaggio e viene indicato il numero di ripetizioni in tandem per ciascun locus polimorfico analizzato.

Questi dati indicano che due membri della famiglia B sono infettati dallo stesso ceppo, mentre un membro è infettato da un ceppo distinto. I membri delle famiglie C sono probabilmente infettati dallo stesso ceppo. Come pure i membri della famiglia A. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come includere abitualmente la PCR multiplex e l'analisi della lunghezza dei frammenti per ottenere profili di DNA VNTR per i pazienti affetti da lebbra che si presentano in ambulatorio.

Questi sono strumenti molecolari innovativi per integrare l'epidemiologia convenzionale nel controllo della lebbra.