Isolamento di colonie di cellule progenitrici neurali indotte derivate da fibroblasti umani adulti

Inizia con una coltura aderente di colonie di cellule progenitrici neurali indotte derivate da fibroblasti umani adulti in una piastra multipozzetto rivestita di laminina.

Lavare le colonie con un tampone per rimuovere le cellule non aderenti, quindi aggiungere un tampone fresco.

Raschiare intorno alle singole colonie per rimuovere le cellule circostanti.

Trasferire le colonie in pozzetti freschi rivestiti di laminina contenenti terreno di neuroinduzione.

Disaggregare meccanicamente le colonie per ottenere una sospensione unicellulare.

La laminina, una proteina della matrice extracellulare, interagisce con le proteine di superficie dei progenitori, facilitando l'adesione cellulare alla superficie del pozzetto.

Aggiungere un inibitore di piccole molecole che entra nelle cellule e blocca specifiche protein chinasi, prevenendo l'apoptosi cellulare.

I fattori di crescita e le piccole molecole presenti nel mezzo di neuroinduzione facilitano la proliferazione dei progenitori.

Sostituire periodicamente il terreno per reintegrare i nutrienti, facilitando la continua proliferazione dei progenitori.

Una coltura confluente, o uno strato cellulare completamente coperto, indica il successo dell'espansione delle cellule progenitrici neurali indotte.

Il giorno dopo, aspirare la laminina dalle piastre e aggiungere 200 microlitri di terreno di induzione neurale ai pozzetti. Lavare le piastre a sei pozzetti contenenti le colonie da prelevare, una volta con DPBS, prima di aggiungere 2 millilitri di terreno di induzione neurale per pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Raccogli meccanicamente le cellule raschiando le colonie usando un ago sottile per sbarazzarti delle cellule circostanti e raccogliendo le colonie usando le punte delle pipette montate su una pipetta da 200 microlitri impostata su 50 microlitri.

Trasferire ogni colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti rivestita di laminina e generare meccanicamente una sospensione a singola cellula pipettando su e giù 10 volte. Aggiungere alle cellule l'inibitore della Rho-chinasi in una concentrazione finale di 10 micromolari. Far crescere le cellule sulla piastra a 48 pozzetti a 37 gradi Celsius, 5% di CO₂ per due giorni. Cambia il terreno ogni due giorni fino a quando le celle raggiungono l'80% al 90% di confluenza.