Avvio dell'estensione e della formazione rapida della neurite Connessioni neuronali funzionali

Inizia assemblando un dispositivo microfluidico contenente microcanali all'interno di un piatto rivestito di lisina.

Seminare neuroni embrionali con un mezzo di crescita nei pozzetti microfluidici, consentendo loro di fluire attraverso i microcanali.

Incubare per facilitare l'attaccamento e la crescita neuronale, formando popolazioni neuronali fisicamente isolate.

Smontare la configurazione e posizionare la capsula in una camera di micromanipolatore con un flusso salino per mantenere la vitalità cellulare.

Introdurre perle rivestite di lisina vicino ai neuroni, consentendo ai neuriti o alle proiezioni cellulari di attaccarsi e formare complessi perlina-neurite.

Utilizzando un micromanipolatore, applicare l'aspirazione per coinvolgere un complesso di perline-neuriti da un canale.

Tirare questo complesso per indurre una tensione meccanica, portando a una rapida estensione dei neuriti.

Guidalo verso un altro complesso perlina-neurone e tienilo con un secondo micromanipolatore.

Tenere entrambe le perline in posizione per facilitare la formazione di una connessione neuritica.

Rilasciare l'aspirazione e sostituire la soluzione salina con un terreno di coltura.

Incubare per stabilire connessioni funzionali tra i neuroni, favorendo la comunicazione attraverso i neurotrasmettitori.

Rimuovere il fluido dai pozzetti superiori dei dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti. Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione cellulare concentrata nel pozzetto in alto a destra del dispositivo microfluidico e controllare al microscopio come scorrono le cellule all'interno del dispositivo microfluidico a singola popolazione.

Per piastrare le cellule nel dispositivo delle popolazioni multiple, aggiungere 20 microlitri della soluzione cellulare concentrata in ciascuno dei pozzetti superiori. Al microscopio, controlla se le cellule sono all'interno delle camere. Successivamente, posizionare i dispositivi nell'incubatrice per 15-30 minuti per favorire l'adesione delle cellule al substrato.

Dopo che le cellule si sono attaccate al substrato, aggiungere 40 microlitri di NBM ai due pozzetti superiori del dispositivo a popolazione singola. Questo aiuterà a rimuovere le bolle d'aria dai microcanali. Aggiungere 20 microlitri di NBM ai pozzetti superiori del dispositivo a popolazioni multiple, gli stessi pozzetti in cui sono state iniettate le cellule. Il terreno dovrebbe sporgere leggermente per formare un menisco positivo e dare ai pozzetti un aspetto simile a quello di un muffin.

Uno o due giorni prima della rimozione dei dispositivi microfluidici, aggiungere 2 millilitri di NBM preriscaldato a ciascun piatto campione e allagare le camere. Quindi, conservare i dispositivi nell'incubatrice. Successivamente, utilizzare una pinzetta sterile e una punta di pipetta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai vetrini, lasciando una configurazione modellata di neuroni.

In questa procedura, aggiungere alla coltura cellulare da 40 a 60 microlitri delle perle rivestite di PDL preparate. Quindi, rimettere il campione nell'incubatrice per un'ora per favorire la formazione di contatti sinaptici. Successivamente, installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le cellule possano essere valutate dall'alto con due micropipette e siano accessibili anche otticamente. In questa configurazione, una telecamera CCD si trova sulla porta laterale del microscopio per l'acquisizione delle immagini. Collegare ogni pipetta riempita di soluzione fisiologica a una siringa da 1 millilitro. Quindi, perfondere il campione con una soluzione salina fisiologica.

Successivamente, al microscopio, controllare il divario tra le due popolazioni neuronali isolate per assicurarsi che le due popolazioni non siano naturalmente collegate. Selezionare un bead PDL che non sia attaccato al neurone nel campo visivo. Allineare il cordone con la punta di una micropipetta concentrandosi sul perlina e poi sulla micropipetta.

Successivamente, portare la punta verso il basso il più vicino possibile al cordone monitorandola attraverso il microscopio. Quindi, applicare una pressione negativa alla pipetta per prelevare il cordone e mantenere la pressione negativa per tutta la durata dell'esperimento.

A questo punto, selezionare una perlina PDL attaccata a un neurone nel campo visivo e collegarla alla seconda micropipetta mediante aspirazione. Estrarre il complesso perlina-neurone PDL muovendo lentamente il micromanipolatore o lo stadio del campione a 0,5 micrometri al minuto per 1 micrometro e fare una pausa di cinque minuti per consentire l'inizio del neurite.

Tirare il complesso perlina-neurone PDL spostandolo lentamente lateralmente a 0,5 micrometri al minuto su 2 micrometri. Quindi, fai una pausa di cinque minuti per consentire l'allungamento dei neuriti. Dopo l'inizio riuscito e l'estensione del neurite per i primi 5 micrometri, tirare continuamente il neurite a 20 micrometri al minuto.

Per collegare i neuroni, seleziona una regione ricca di neuriti. Utilizzare altre perle per misurare l'altezza della punta della pipetta sopra il vetrino coprioggetti e abbassare il complesso perlina-neurite PDL in modo che entri fisicamente in contatto con i neuriti. Lasciare il complesso perlina-neurite PDL a contatto con il neurite bersaglio mentre si manipola la seconda micropipetta. Quindi, abbassare la seconda pipetta con la seconda perlina PDL sopra il neurite appena formato a circa 20 micrometri dalla prima perlina e utilizzare la seconda perlina PDL per spingere il nuovo filamento di neurite verso la cellula bersaglio.

Quindi, tieni entrambe le perline in posizione per almeno un'ora. Verificare l'assenza di rigonfiamento focale, un ispessimento dei neuriti a contatto con la perlina con il microscopio. Durante questo periodo, cambiare lentamente il mezzo del campione da soluzione fisiologica a NBM pre-riscaldato bilanciato con anidride carbonica.

Rilasciare il cordone dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione. Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilascia anche la prima velocità. Successivamente, riposizionare con cura il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per esperimenti futuri.