Name: Strategie di trapianto di cellule staminali per il Restauro di disfunzione cognitiva causata da radioterapia craniale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Scopri il trapianto di cellule staminali neurali nell'ippocampo di ratti atimici dopo radioterapia stereotassica. Questo metodo dimostra la migrazione cellulare per studiare il recupero cognitivo post-irradiazione cranica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NINDS concedere R01 NS074388 581 (CL Limoli), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Grant RS1-00413 (LLC), CIRM formazione di Grant TG2-0115 (MMA), e una sovvenzione CIRM a Giove a sostegno della documentazione video.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La ricerca è in corso un notevole esplorando la miriade di modi in cui le cellule staminali possono essere usati clinicamente per ripristinare le normali funzioni a tessuti danneggiati, invecchiato e malato 8. L&#39;eventuale realizzazione di questi sforzi richiederanno una conoscenza dettagliata del comportamento delle cellule trapiantate in microambienti unici che si distinguono dalle intatto tessuto normale. Il nostro lavoro ha dimostrato che all&#39;interno del letto del tessuto irradiato, NSCs cranialmente innestati può ripristinare funzionalmente cognizione, dove sopravvivono, migrano e si differenziano lungo linee neurali e gliali 2. Proprio come queste cellule mediare il recupero della cognizione è incerta al momento, ma non dipende da conducendo una serie di procedure sperimentali attentamente controllata in maniera riproducibile. Abbiamo queste procedure dettagliate critiche qui nel tentativo di accelerare il potenziale traslazionale di terapie con cellule staminali per ameliorating avversi effetti cognitivi associatigestione clinica del cervello e di altre forme di cancro. Ulteriori considerazioni che possono avere un impatto significativo della qualità dei dati sono evidenziati di seguito. Terapie a base di trapianto dipende da cellule staminali come il reagente critico, e di conseguenza, la cura deve essere esercitata per caratterizzare adeguatamente le culture, mantenere la sterilità e di utilizzare i numeri passaggio abbinati per l&#39;affidabilità dei risultati. Trapiantato cellule staminali umane sono stati etichettati con BrdU prima dell&#39;intervento, per fornire un mezzo per il monitoraggio in vivo. Nelle nostre condizioni sperimentali, NSCs trapiantato non ha subito la proliferazione estesa, in modo che la diluizione del marchio BrdU non è stato problematico. In alternativa, trapiantato cellule staminali umane possono essere distinte dalle cellule ospiti mediante immunocolorazione per il consumo umano marcatori specifici come la proteina di matrice nucleare (h-NUC o hNUMA) 9 o umano-specifico antigene nucleare (HuNu) 2. Le cellule staminali umane potrebbe anche essere etichettati conuna serie di marcatori fluorescenti per facilitarne l&#39;identificazione all&#39;interno del cervello ospitante. Attenzione ai parametri di irradiazione definire con precisione le tecniche di erogazione della dose, e quelle qui descritte modello attuali pratiche cliniche in oncologia di radiazione. Trapianto riproducibile di cellule staminali nel cervello è anche critica, ed è realizzato utilizzando uno strumento digitale stereotassico. La capacità di micromanipulate proprio un micro-siringa per l&#39;impianto di cellule staminali in strutture del cervello piccolo come l&#39;ippocampo, riduce notevolmente l&#39;errore umano. Con questo apparato, NSC sono stati trapiantati in quattro siti diversi che attraversa il posteriore, anteriore alle regioni dell&#39;ippocampo di ratto. Dorso-ventrale (DV) coordinate sono state determinate in base all&#39;esperienza atimici nudo (ATN) ratti tale che gli interventi chirurgici non provocherebbe danni alla formazione dell&#39;ippocampo 2. Una sezione coronale attraverso il cervello del ratto rivela strutture chiave della incl formazione dell&#39;ippocampouding il giro dentato (DG), il dentato ilo (DH) e CA1 e CA3 sottocampi (Fig. 8). NSC trapiantati, introdotto dorsalmente dal tratto ago visibile (Nt, Redline), vengono visualizzati come colorazione scura (marrone), le cellule depositate presso il trapianto-release del sito (Tr) proprio sotto il corpo calloso (CC), che successivamente migrare in tutto il setto -temporale asse dell&#39;ippocampo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Strumento digitale Stereotassica w/45 ° e 18 ° Earbars </td><td> Cranica trapianto chirurgico di setup </td><td> Leica Microsystems (in precedenza: MyNeuroLab) </td><td> 39463501 </td><td> Utili accessori: Stage con riscaldamento e variabile sorgente di corrente (per mantenere la temperatura corporea durante l&#39;intervento chirurgico) </td></tr></tbody></table>

strategie di trapianto di cellule staminali per il restauro di disfunzione cognitiva causata da radioterapia craniale

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radioterapia fornisce spesso l&#39;unica ricorso clinica per malati di tumori cerebrali primari o metastatici. Mentre benefici, irradiazione cranica può indurre un declino progressivo e invalidante nella cognizione che possono, in parte, essere causati dalla deplezione delle cellule staminali neurali. Dato l&#39;aumento della sopravvivenza dei pazienti con diagnosi di tumore al cervello, qualità della vita in termini di salute cognitiva è diventata una crescente preoccupazione, soprattutto in assenza di una soddisfacente trattamenti a lungo termine. Per risolvere questo serio problema di salute che abbiamo usato cellule staminali sostituzione come strategia per combattere la radiazione indotta declino cognitivo. Il nostro modello utilizza atimici ratti nudi sottoposti a irradiazione cranica. La radiazione ionizzante viene consegnato sia come intero cervello o come un fascio altamente focalizzato l&#39;ippocampo attraverso l&#39;orecchio di un lin (LINAC) ccelerator radiochirurgia stereotassica base. Due giorni dopo irradiazione, huLe cellule staminali neurali dell&#39;uomo (hNSCs) sono stati trapiantati in stereotaxically l&#39;ippocampo. I ratti sono stati poi valutati per cambiamenti cognitivi, la sopravvivenza delle cellule innestate e per l&#39;espressione di specifici marcatori di differenziazione-1 e 4 mesi dopo l&#39;irradiazione. I nostri paradigmi test cognitivi hanno dimostrato che gli animali innestati con hNSCs mostrano significativi miglioramenti delle funzioni cognitive. Stereologia Tutti rivela sopravvivenza significativa (10-40%) delle cellule trapiantate a 1 e 4 mesi dopo il trapianto, dipende dalla quantità e dal tipo di cellule innestate. Cellule engrafted migrare, differenziare lungo linee gliali e neuroni, ed esprimere una gamma di marcatori fenotipici immaturi e maturi. I nostri dati dimostrano direct benefici cognitivi derivanti da innestate cellule staminali umane, suggerisce che questa procedura potrebbe un giorno permettere una strategia promettente per il lungo periodo di restauro funzionale della cognizione negli individui sottoposti a radiot cranialherapy. Per promuovere la diffusione delle procedure critica necessaria per replicare ed estendere i nostri studi, abbiamo fornito una documentazione scritta e visiva di alcuni passaggi chiave del nostro piano sperimentale, con particolare attenzione alla stereotaxic radiosurgey e il trapianto.

Pazienti con tumore al cervello sottoposti a radioterapia cranica di routine, e per quanto utili, questo trattamento si traduce spesso in debilitanti disfunzione cognitiva. Questo grave problema irrisolto è allo stato attuale, alcun ricorso clinica, e ha spinto i nostri sforzi per ideare terapie con cellule staminali base per il recupero della radiazione indotta decrementa cognitive.

Strategie di trapianto di cellule staminali per il Restauro di disfunzione cognitiva causata da radioterapia craniale

La radioterapia rappresenta spesso l'unico ricorso clinico per i pazienti affetti da tumori cerebrali primari o metastatici. Sebbene sia vantaggiosa, l'irradiazione cranica ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è trapiantare riproducibilmente cellule staminali nell'ippocampo. In primo luogo, i ratti atimici vengono sottoposti a radioterapia stereotassica, simulando ciò che potrebbe verificarsi durante la gestione clinica del cancro al cervello. In laboratorio, vengono coltivate cellule staminali neurali umane per il trapianto; tipicamente, sono richieste 1 milione di cellule per il trattamento di un singolo ratto.Due giorni dopo l'irradiazione, le cellule staminali vengono iniettate lentamente nell'ippocampo in una posizione precisa. In definitiva, il protocollo mostra la migrazione delle cellule staminali trapiantate in tutto l'ippocampo. Ebbi per la prima volta l'idea di queste metodologie quando iniziai a considerare le prospettive dell'utilizzo delle cellule staminali per invertire l'inibizione della neurogenesi dopo irradiazione cranica. Generalmente, le persone a conoscenza di questo metodo incontreranno difficoltà poiché la crescita delle cellule staminali non è semplice e richiede attenzione e cura quotidiane in condizioni di crescita libere da antibiotici.La dimostrazione visiva di questa procedura chiarirà il processo clinico utilizzato per la ricostruzione delle immagini, necessario per l'irradiazione precisa di piccoli volumi cerebrali ben definiti. A illustrare la procedura di irradiazione sarà il dottor Dante Rowa, professore clinico del mio dipartimento. La preparazione delle cellule staminali sarà mostrata dalle tecnici del mio laboratorio, signorina Mary Land e Catherine Tran, mentre il dottor Muja, ricercatore postdottorato, illustrerà le procedure necessarie per il trapianto.Utilizziamo un software di radioterapia guidata da immagini per un posizionamento preciso dell'animale prima del trattamento e una radioterapia modulata per un'irradiazione mirata con il minimo danno da radiazioni ad altre parti del cervello. 24 ore dopo una scansione MRI, generare un ulteriore volume di immagini tomografiche posizionando l'animale sedato in uno scanner CT per radioterapia. Posizionare il ratto nella stessa posizione utilizzata per la scansione MRI e impostare lo scanner CT per acquisire la regione del cranio al fine di generare i dati necessari per la pianificazione del trattamento.Ottenere 106 immagini TC con uno spessore di 0,8 millimetri. Successivamente, trasferire i dati delle immagini RM e TC al software di pianificazione del trattamento Eclipse. Utilizzare Eclipse per fondere i dati RM e TC in base alla corrispondenza dell'anatomia ossea e dei tessuti molli.Questo passaggio dipende dal tempo e, in base alla qualità dell'immagine, il processo può richiedere da una a tre ore. Una volta ottenuta una fusione delle immagini soddisfacente, delineare le regioni bersaglio da irradiare così come gli organi critici adiacenti. L'irradiazione può essere somministrata a tutto il cervello oppure limitata a specifiche regioni volumetriche, come singoli ippocampi.I contorni forniscono non solo la posizione di questi organi, ma anche informazioni sul volume che saranno fondamentali per personalizzare la distribuzione della dose. Per personalizzare la distribuzione della dose, inserire nel riquadro di ottimizzazione della dose di eclipse le informazioni relative alla dose bersaglio, alla conformità del bersaglio e ai vincoli di dose per gli organi critici.Una volta generato un piano, Eclipse fornisce la dose calcolata sovrapposta alle immagini assiali, coronali e sagittali, nonché in formato di istogramma volume-dose. È a questo punto che il piano deve essere valutato per determinarne l'idoneità all'applicazione o la necessità di miglioramenti. Per iniziare il processo di irradiazione, posizionare un ratto sedato sotto una coperta di carta per mantenerlo al caldo.Dopo alcuni minuti, posizionare il ratto sul tavolo di trattamento dell'acceleratore lineare per radioterapia, coperto con la coperta ma con il cranio esposto. Assicurarsi di posizionarlo nella stessa posizione utilizzata per acquisire la scansione TC. Questo passaggio è fondamentale per garantire l'accuratezza nella somministrazione della dose.Successivamente, acquisire immagini ortogonali a raggi X dei ratti sedati utilizzando il sistema di imaging integrato nell'acceleratore lineare per radioterapia; coregistrare le immagini ortogonali a raggi X a un set di immagini di riferimento fornito da Eclipse e procedere applicando le necessarie correzioni di posizione per un corretto allineamento delle immagini. Erogare l'irradiazione come dose in 10 frazioni con un piano IMRT a sei campi per un singolo ippocampo e con un piano RapidArc a due archi per l'irradiazione di entrambi gli ippocampi. Al termine dell'erogazione del trattamento, rimuovere l'involucro dalla stanza di trattamento e consentire al soggetto di riprendersi in una gabbia riscaldata di attesa.Per prepararsi alla chirurgia, utilizzare delle forbici elettriche per rimuovere il pelo dalla testa di un ratto A TN anestetizzato. Pulire l'area rasata applicando ripetutamente iodopovidone ed etanolo al 70%, operando all'interno di una cappa a flusso laminare. Preparare gli strumenti stereotassici, il trapano micrometrico, il sterilizzatore a letto asciutto e i relativi controllori.Mantenere l'animale al caldo durante l'intervento chirurgico posizionandolo su una superficie riscaldata. Indossare guanti sterili prima e durante tutta l'operazione, spruzzandoli con etanolo al 70%. L'equipaggiamento chirurgico viene conservato all'interno di un'apposita cappa a flusso laminare.Per mantenere le condizioni asettiche, coprire l'animale con un piccolo telo chirurgico in modo che sia esposta solo la testa. Posizionare saldamente la testa dell'animale all'interno del telaio stereotassico inserendo le barre auricolari nell'orecchio esterno. Prestare la massima attenzione durante l'inserimento della punta della barra auricolare nel condotto uditivo.Posizionare la barra degli incisivi agganciando gli incisivi superiori del ratto e regolando l'altezza della barra fino al punto di riferimento standard. Quindi stringere il morsetto del muso. Centrare la posizione della testa tra le barre auricolari con il minimo movimento laterale per raggiungere lo zero stereotassico.Dopo aver posizionato l'animale, applicare un unguento oculare lubrificante per prevenire l'essiccazione. Applicare nuovamente l'unguento una seconda volta durante l'intervento chirurgico. Utilizzando un bisturi sterile, praticare un'incisione cutanea mediana di due centimetri lungo il cuoio capelluto.Pulire l'area utilizzando un applicatore sterile con punta di cotone. Successivamente, inserire un retrattore da dissezione per mantenere aperta la periosteo. Applicare una pressione ferma sulla zona se si verifica sanguinamento.Utilizzando un applicatore di cotone imbevuto di perossido di idrogeno al 1%, rimuovere i tessuti molli che ricoprono il cranio fino a quando le saldature bgma e lambda diventano visibili. L'aspetto più delicato dell'intervento stereotassico è il posizionamento preciso della testa dell'animale nel telaio stereotassico. Per segnare con precisione le coordinate stereotassiche sul cranio dell'animale, utilizzare un atlante cerebrale avvolgente per determinare le coordinate stereotassiche esatte utilizzando la bgma come riferimento. In questo studio, il trapianto di cellule staminali viene effettuato in quattro siti distinti utilizzando le seguenti coordinate stereotassiche per indicare le posizioni sul cranio; innanzitutto, identificare la bgma.Quindi azzerare tutte e tre le coordinate sul controller del display digitale. Una volta azzerate, utilizzare le coordinate predeterminate per individuare i siti di trapianto e fare un segno con un pennarello a punta fine collegato a un porta-provetta sul telaio.Utilizzare un trapano per praticare fori di 0,35 millimetri attraverso il cranio in corrispondenza di ciascuna posizione segnata. Prestare attenzione a non danneggiare la membrana di Durham. In caso di sanguinamento durante la perforazione, applicare una pressione ferma utilizzando un applicatore con estremità di cotone.L'animale è ora pronto per il trapianto. Le cellule staminali neurali umane utilizzate per il trapianto devono essere preparate in anticipo e mantenute sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Quando si è pronti, riempire una microsiringa Hamilton da cinque microlitri con ago da 30 gauge con la sospensione cellulare.Collegare la siringa riempita a un piccolo supporto per sonda sul telaio stereotassico. Una volta posizionato nella corretta sede, inserire con attenzione la punta dell'ago nel foro del cranio fino a raggiungere la superficie del cervello. Azzerare la coordinata DV sul controller con display digitale e quindi inserire delicatamente l'ago alla profondità desiderata.Mantenere l'ago in posizione per un minuto. Trascorso questo tempo, iniettare le cellule a un ritmo di 0,25 microlitri al minuto per un totale di un microlitro. Mantenere l'ago in posizione per otto minuti prima di ritrarlo per prevenire il reflusso capillare del contenuto dell'iniezione attraverso il tratto dell'ago; ritrarre lentamente l'ago dal sito di trapianto a un ritmo di 0,5 millimetri al minuto.Ripetere questa procedura per i siti di trapianto rimanenti. Al termine delle iniezioni, rimuovere il retrattore cutaneo e utilizzare pinze smussate per riportare delicatamente la pelle sulla scatola cranica. Chiudere la ferita applicando quattro o cinque clip sterili in acciaio inossidabile dopo l'intervento chirurgico.Posizionare l'animale in una gabbia riscaldata e monitorarne il recupero. Un mese dopo il trapianto, i campioni cerebrali sono stati sezionati e colorati con BRDU per rilevare le NSC trapiantate e controcolorati con ematina. Il percorso dell'ago, rappresentato dalla linea rossa, indica la traiettoria di iniezione che ha depositato le NSC nel sito di rilascio del trapianto indicato come TR, come mostrato.Qui, le NSCS trapiantate hanno mostrato un'estesa migrazione dalle regioni del corpo calloso e CA1 alle regioni del giro dentato e CA3 dell'ippocampo. È fondamentale utilizzare con precisione il set di immagini RM acquisite, abbinandolo correttamente al corrispondente set di immagini TC. Una corretta fusione delle immagini è essenziale per l'identificazione e la successiva delimitazione delle regioni ippocampali prima della procedura di trattamento; acquisire immagini ortogonali a raggi X per assicurare un posizionamento accurato dell'animale. Per garantire il successo del trapianto, mantenere in ogni momento un ambiente chirurgico sterile.Segnare con precisione le coordinate di Otax e rimuovere gradualmente la microsiringa dopo l'iniezione per prevenire il reflusso del liquido. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire una procedura radiologica clinicamente rilevante utilizzando un modello animale a scelta e di come trapiantare chirurgicamente cellule staminali in una regione precisa del cervello.

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