Isolamento di cellule staminali dal cervelletto di topo postnatale e differenziazione in cellule neurali

Prendi le cellule isolate da un cervelletto di topo neonato contenente cellule staminali, neuroni e glia.

Aggiungere microsfere magnetiche rivestite di anticorpi che si legano a una glicoproteina di superficie specifica per le cellule staminali.

Centrifugare, rimuovere le perle non legate e risospendere le cellule in un tampone.

Caricare le cellule su una colonna di separazione posta in un separatore magnetico, che trattiene le cellule staminali legate alle microsfere mentre le altre cellule fluiscono.

Aggiungere un mezzo di neurosfera per eluire le cellule e trasferirle in una micropiastra. Incubare per indurre la formazione di neurosfere primarie, colonie autorinnovanti di cellule staminali.

Centrifugare e scartare il terreno. Risospendere le neurosfere in un mezzo contenente enzimi per digerire le proteine di adesione cellulare.

Centrifugare e rimuovere gli enzimi. Aggiungere il mezzo della neurosfera e dissociare meccanicamente le cellule.

Incubare per consentire la proliferazione delle cellule staminali e la formazione secondaria della neurosfera, mentre le cellule differenziate prive delle caratteristiche delle cellule staminali non proliferano.

Trasferire le neurosfere in un mezzo di differenziazione e incubarle, promuovendo la differenziazione in neuroni e glia.

Posizionare le provette da centrifuga sul ghiaccio, quindi filtrare le cellule dissociate attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta da 50 millilitri. Riempire il filtro con 10 millilitri di soluzione HBSS ghiacciata, per garantire che le cellule passino attraverso la rete.

Trasferire le cellule filtrate in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri e centrifugare la sospensione a 300 volte g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere completamente il surnatante.

Risospendere il pellet della cella in 160 microlitri di tampone a colonna magnetica ghiacciato. Aggiungere 40 microlitri di microsfere anti-prominina-1 alla sospensione cellulare. Quindi, incubare le provette in frigorifero per 15 minuti, per consentire all'anticorpo di legarsi alle cellule che esprimono la prominina-1.

Lavare le cellule con 1 o 2 millilitri di tampone X della colonna e centrifugarle a 300 volte g per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone X per colonna. Posizionare le colonne magnetiche sul supporto magnetico e sciacquarle una volta con 500 microlitri di tampone X. Applicare la sospensione cellulare marcata sulla colonna e raccogliere il flusso in provette fresche da 15 millilitri.

Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone X. Quindi, rimuovere le colonne dal campo magnetico e posizionarle in tubi da 1,5 millilitri. Aggiungere 1 millilitro di terreno di coltura e spingere lo stantuffo nella colonna per eliminare le cellule etichettate con perle di prominina-1.

Per far passare le neurosfere, trasferirle insieme al terreno di coltura in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Pellettare le neurosfere mediante centrifugazione a 300 volte g per 5 minuti e scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in 5 millilitri di terreno di dissociazione con papaina o soluzione di tripsina allo 0,05% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare. Quindi, risospendere le cellule in 5 millilitri di terreno neurosferico e dissociarle pipettandole lentamente su e giù 10 volte con una pipetta da pascolo. Placcare le cellule in terreni di neurosfera come descritto nel protocollo di testo e arricchirle con neurosfere secondarie dopo 7-10 giorni di coltura come descritto in precedenza.