Microfabbricazione post-Array-Detector (mPADs): un approccio per isolare le forze meccaniche

Ciao, sono Nathan Snia Decky e con me oggi ci sono Wes Ligan, Robbie Desai e Mike Yang. Proveniamo tutti dal laboratorio di Chris Chen presso l'Università della Pennsylvania. In questo video presenteremo il nostro approccio per misurare le forze di attrazione cellulare mediante un array microfabbricato di pali.

Le forze di trazione sono generate attraverso interazioni tra miosina e actina e svolgono un ruolo importante nella nostra fisiologia. Durante lo sviluppo, consentono alle cellule di spostarsi da una posizione all'altra al fine di formare le prime strutture dei nostri tessuti. Inoltre, contribuiscono al processo di guarigione poiché sono necessarie per la chiusura delle ferite o per la migrazione e il movimento strisciante dei leucociti attraverso il nostro corpo.

Purtroppo, tuttavia, queste stesse forze possono risultare dannose per la nostra salute nel caso della metastasi tumorale o della crescita vascolare verso un tumore. Esistono quindi pochissimi metodi con cui è effettivamente possibile misurare in modo quantitativo queste forze di trazione, specialmente alle scale micro e nanometriche delle singole cellule. La maggior parte dei metodi comunemente utilizzati per lo studio delle cellule in vitro prevede l'uso di piatti con fondo in vetro o in polistirene, ma questi sono substrati molto rigidi e non ci permettono di misurare fisicamente le forze di trazione e le deformazioni provocate da una cellula.

Pertanto, è stato molto difficile comprendere i meccanismi alla base delle forze di trazione senza un tipo di lettura fisica. Nel laboratorio di Chris Chen abbiamo quindi sviluppato una tecnica che ci permette di superare questi limiti. Il nostro metodo si basa su un array verticale di cantilever flessibili, la cui rigidità e scala dimensionale sono tali per cui singole cellule si espandono su più cantilever e li deflettono nel processo.

Le dimensioni che utilizziamo più frequentemente sono cilindri di tre micron di diametro, alti 10 micron, con un passo centro-centro di nove micron disposti in un reticolo rettangolare. Tuttavia, queste dimensioni possono essere modificate per adattarsi a diverse tipologie di studi cellulari. Partiamo da un master rigido in silicio, visibile qui, e successivamente lo trasformiamo in cantilever flessibili in PDMS, come mostrato qui.

Utilizzando questa tecnica, possiamo misurare le deflessioni dei singoli cantilever al microscopio e risalire alle forze di trazione cellulare, con l'entità e la direzione necessarie per generare tali deflessioni. Abbiamo trasformato questi substrati in pad M per rilevatori a matrice di micropilastri e in questo video vi mostreremo come fabbricare i pad M, partendo dal master in silicone, passando attraverso la replica in PDMS, fino al calcolo della modulazione e della contrattilità cellulare. Ciao, siamo nel laboratorio della nostra camera bianca.

Questa è una stanza libera da polvere e sensibile alla luce, che ci permette di realizzare i pali in SU-8 che fungeranno da stampo in silicio. Partiremo da un wafer di silicio e lo ricopriremo con un resist foto-sensibile SU-8; l'SU-8 è un resist negativo ed è sensibile alla luce. Quando illuminiamo attraverso questa maschera fotolitografica, la luce andrà a definire il pattern dei micropali, formando una struttura tridimensionale, che corrisponderà ai pali in SU-8 successivamente riprodotti in PDMS.

Dopo aver completato tutte le fasi di lavorazione, la piastrina avrà questo aspetto, con le microstrutture a pilastro e a palo già realizzate sulla piastrina. Per realizzare i master, si parte da una piastrina di silicio nuda, che è stata pulita con un trattamento all'ozono per sette minuti e disidratata per 30 minuti a 120 gradi Celsius. Successivamente, si procederà a stendere per centrifugazione l'SU-8 2002 su questa piastrina per formare uno strato di base molto sottile destinato ai pali.

Poiché procederemo a centrifugare l'SU8, indosserò una maschera antigas, ricaricherò la wafer in questo portacampioni qui, eliminerò qualsiasi polvere presente, la posizionerò sulla centrifuga e controlleremo che sia centrata. Dopodiché verseremo l'SU8 2002 sulla superficie. Procederemo quindi a centrifugare la wafer. Successivamente, posizioneremo queste sulla piastra riscaldata per la cottura soft.

Facciamo ciò per un minuto successivamente. Poi lo preleviamo e lo trasferiamo sulla piastra riscaldata a 95 gradi. E proseguiamo per due minuti.

E una volta terminato, prenderemo questo e procederemo con l'esposizione uniforme nell'allineatore di maschere. Ok, abbiamo appena centrifugato l'SU-8, il primo strato di SU-8 su questo wafer, e ora dobbiamo esporre uniformemente l'intero wafer per creare il primo strato di base per i microperni. Dobbiamo quindi fornire un'esposizione di 70 millijoule.

Pertanto, dobbiamo misurare l'intensità effettiva della luce nel nostro allineatore di maschere. Carichiamo quindi il misuratore nell'allineatore di maschere ed esponiamo il dispositivo alla luce.

Questa è luce UV. Carichiamo la piastrina di silicio sull'allineatore della maschera, posizionandola nell'allineatore. Questa volta non abbiamo una maschera, quindi possiamo esporre l'intero film.

Mettiamo lo scatto e impostiamo un'esposizione di un minuto, quindi procediamo con l'esposizione. Dopo un minuto, quando il sistema ha terminato, possiamo rimuovere la piastrina. Ora dobbiamo effettuare la cottura post-esposizione.

Abbiamo appena esposto questa piastrina e ora applicheremo calore per indurre la reazione di reticolazione per questo primo strato di SU eight. La posizioniamo quindi su una piastra riscaldata a 65 °C per un minuto, poi la trasferiamo su una piastra riscaldata a 95 °C per due minuti. Al termine del processo di due minuti, spegniamo la piastra riscaldata e lasciamo raffreddare la piastrina fino alla temperatura ambiente, operazione che richiede circa 30 minuti.

Quindi abbiamo depositato il secondo strato di SU-8 su questa piastrina. Ora dobbiamo esporlo effettivamente attraverso la maschera fotolitografica. Questa volta utilizzeremo un filtro UV per bloccare la luce UV profonda.

Questo è un vetro ottico Hoya che si può ottenere, ma questa volta dobbiamo nuovamente misurare l'intensità. Pertanto utilizzeremo il nostro misuratore di luce oppure useremo il filtro posto in alto per misurare l'intensità che è stata filtrata. Successivamente caricheremo la maschera nell'allineatore di maschere.

Questo interruttore crea un vuoto che tiene la maschera in posizione. Successivamente, la posizioneremo nell'allineatore di maschere. Poi collocheremo il filtro in alto e inseriremo il nostro wafer.

Vogliamo assicurarci che ci sia un buon contatto, quindi solleviamo il campione fino al contatto e poi avvieremo l'esposizione. Dopo l'esposizione, rimuoveremo il nostro wafer dall'allineatore della maschera. A questo punto abbiamo aree che sono state esposte selettivamente. Porteremo questo nel forno, sulle piastre calde, per effettuare la cottura post-esposizione.

Abbiamo appena eseguito il po, il trattamento termico finale dopo l'esposizione, e ora procederemo allo sviluppo di questo wafer per ottenere effettivamente le strutture tridimensionali. Quello che faremo è lavare il campione sviluppandolo in P-G-M-E-A, che rimuoverà l'SU-8 non esposto. Cominciamo quindi con un bagno di P-G-M-E-A, immergendo il wafer per due minuti con un'agitazione delicata.

Quindi lascerò agire per due minuti. Successivamente trasferiremo in una seconda piastra contenente P-G-M-E-A. Questo rimuoverà il P-G-M-E-A saturo con SU otto.

Dopo 10 secondi lo immergeremo nell'IPA. Questo rimuove il P-G-M-E-A. Lo lasciamo qui per 20 secondi, nuovamente con una leggera agitazione.

E ora abbiamo le strutture autonome dei pali. Le immergeremo nell'esano, che ha una bassa tensione superficiale. Procederemo con un lavaggio di cinque secondi nel primo e poi nel secondo esano, dopodiché sarà pronto per essere asciugato con aria compressa.

Abbiamo appena sviluppato il wafer e ora lo posizioneremo su una piastra riscaldante, aumentando lentamente la temperatura fino a 150. Ciò che accade è che l'elevata temperatura induce un ulteriore reticolazione dell'SU-8, rendendolo più rigido dal punto di vista strutturale; lasciamo il wafer sulla piastra riscaldante per tutta la notte, per un periodo compreso tra 14 e 20 ore. Successivamente, spegneremo la piastra riscaldante e lasceremo raffreddare il wafer fino alla temperatura ambiente.

Quello che dobbiamo fare è sminuzzare questa piastrina in un formato più piccolo. Fondamentalmente, vogliamo tagliare questa piastrina di silicio e creare un piccolo chip contenente soltanto questo schema interno qui. E avrà un aspetto simile a questa struttura, in cui verrà utilizzata una resina epossidica.

E incolleremo quel chip su un vetrino in questo modo. Questo fornisce un supporto strutturale. Per sezionare una wafer, si tratta più che altro di un'arte, ma ciò che si può fare è utilizzare fondamentalmente uno stilo di diamante e iniziare da un solo bordo.

E a causa dei piani cristallini, si pratica una piccola incisione. Ora si è creata una frattura, che posso colpire con questo strumento. Possiamo staccare questa parte e poi effettuare ulteriori tagli qui, finché non otteniamo una struttura piccola come questa. Quindi si posiziona rapidamente il chip di silicio sul vetro e lo si monta al suo posto. E lo si lascia indurire.

E così, una volta terminato, avrete un dispositivo simile a questo. Abbiamo montato il master in silicio su questo vetrino di vetro e ora andremo a ricoprirlo con un rivestimento di floy, che faciliterà il successivo rilascio della struttura dal PDMS. Posizioneremo quindi il chip in questo desiccante e poi preleveremo alcune gocce di tri Chloro Siling, aggiungendo alcune gocce nel desiccante.

Eseguiamo questa operazione all'interno della cappa perché si genera un sottoprodotto di gas cloridrico, che è piuttosto aggressivo. Chiudiamo il coperchio, colleghiamolo al vuoto e poi lasciamo riposare sotto vuoto, permettendo al materiale di depositarsi durante la notte per ottenere un rivestimento uniforme su tutta la superficie della wafer di silicio. Ciao, sono Wesley Ligan.

Sono uno studente laureato nel laboratorio di Christopher Chen. A questo punto, Nate ti ha mostrato come creare un master in silicone per i nostri substrati ED. Tuttavia, prima di poter utilizzare questo strumento per misurare la contrattilità cellulare, è necessario riprodurre le strutture fotoresistenti rigide utilizzando un polimero di silicone elastomerico.

Il nostro primo compito consiste nel generare un modello negativo del master in silicone che abbiamo realizzato in precedenza. Per fare ciò, utilizziamo un elastomero di silicone chiamato PDMS o polimetilsilossano, aggiungendo al polimero PDMS un rapporto di uno a dieci di agente indurente.

Dopo aver pesato la soluzione, è necessario mescolare accuratamente il polimero PDMS e l'agente incrociante. Questo mescolamento introduce ovviamente molte bolle d'aria nella nostra soluzione. Pertanto, a questo punto, è necessario rimuovere il coperchio e sottoporre la soluzione a degasaggio nel desiccante sotto vuoto.

Una volta che il PDMS è completamente degasato e tutte le bolle sono risalite in superficie scoppiando, possiamo rimuoverlo dal desiccante sotto vuoto. Possiamo ora utilizzare questa miscela di PDMS e agente di reticolazione per generare uno stampo negativo del nostro master in silicio. Per fare ciò, usiamo un contenitore di alluminio e posizioniamo il master in silicio montato al centro di esso.

Successivamente versiamo con attenzione la soluzione polimerica di DGAs nella capsula sopra il wafer di silicio, cercando di evitare la formazione di ulteriori bolle. In genere cerchiamo di versare il polimero in uno strato spesso circa un quarto di pollice. Si può notare che questo processo inevitabilmente introduce alcune bolle d'aria nella miscela.

Ora mettiamo da parte questa piastra per circa 30 minuti, in modo da permettere alle bolle di salire in superficie e scoppiare. Possiamo osservare che, dopo averla lasciata riposare, ci sono ancora alcune bolle d'aria sulla superficie del PDMS. Tuttavia, poiché si trovano sulla superficie superiore, possiamo ora utilizzare un breve getto di azoto per eliminare le bolle rimanenti.

Per completare la reticolazione della soluzione di PDMS e del RETICOLANTE e generare un calco negativo rigido del nostro master in silicio, si effettua una cottura a 110 gradi Celsius per 20 minuti. Si può osservare uno strato sottile di PDMS sulla superficie del substrato in silicone. Prima di poter separare i due strati, è necessario rimuovere preventivamente questo strato.

Successivamente possiamo innestare questo strato superiore e staccarlo delicatamente dal substrato di silicio. A questo punto, possiamo capovolgere e staccare molto lentamente il substrato di silicio negativo, ovvero il substrato di PDMS negativo, dallo stampo in silicone. Ok, eseguiamo questa operazione tenendo ferma un'estremità e staccando delicatamente il substrato di PDMS.

È possibile osservare l'avanzamento frontale mentre il substrato si stacca dal master in silicone. Ora che abbiamo realizzato il negativo A-P-D-M-S del nostro master in silicone, possiamo tagliare questo negativo in quattro stampi negativi individuali per produrre i substrati finali delle piastre. A questo punto è importante non toccare la superficie superiore del substrato negativo con pinzette o guanti per evitare di danneggiare la superficie.

A questo punto, abbiamo generato quattro singoli stampi negativi dal master in silicone, costituiti da pozzi di tre micron di diametro e nove micron di profondità. Per rigenerare le superfici rialzate della mensola, possiamo eseguire un'ulteriore stampatura su questi stampi negativi utilizzando PDMS a base di PDI. Tuttavia, prima di procedere, è necessario rendere non adesivi questi stampi negativi rivestendoli con un fluoruro.

Eseguiamo questo in una camera a plasma da cento watt alla massima potenza per un minuto. Dopo aver permesso alla camera di ripompare e riattivare il plasma, si genera un campo di gas ionizzato che incide la superficie superiore del PDMS e la rende più adesiva alle molecole di fluoro Cy Lane. Dopo aver rimosso gli stampi negativi dal desiccante sotto vuoto, è possibile osservare che ciò che rimane è un reticolo di pozzi profondi da tre a dieci micron in un livello di PDMS non adesivo.

Per rigenerare i cantilever verticali, che utilizziamo come substrati mpad, è necessario eseguire nuovamente la stampatura partendo da questo utilizzando la stessa miscela di PDMS, ottenendo così un array positivo di cantilever elastomerici autosostenuti, che rispecchia in modo identico il master in silicio realizzato in precedenza. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel trasferire i nostri stampi negativi non adesivi su un supporto di montaggio realizzato con strisce di PDMS e un vetrino da microscopio in vetro. La funzione di questo dispositivo diventerà chiara nel passaggio successivo.

A questo punto, possiamo depositare una piccola goccia della nostra stessa miscela di PDMS in rapporto 10 a 1 con l'agente reticolante già sottoposta a degasaggio sulla superficie superiore di ciascuno dei nostri stampi negativi. È necessaria solo una piccola quantità di PDMS, in modo che non coli sui bordi degli stampi negativi. A questo punto.

Per distribuire in modo più uniforme il PDMS sulla superficie superiore degli stampi, è possibile prenderne uno con una pinzetta, capovolgerlo e metterlo a contatto con lo stampo adiacente, spargendo con attenzione il PDMS in modo da coprire completamente l'intero substrato. Prestare molta attenzione in questo passaggio per non introdurre ulteriori bolle nella soluzione di PDMS superiore; quindi ripetere l'operazione con le altre due pozzette e gli altri due stampi. Ora che abbiamo un rivestimento di PDMS più uniforme sulla superficie superiore, possiamo posizionare questo dispositivo in un essiccatore sotto vuoto per rimuovere ulteriormente eventuali bolle intrappolate nel film di PDMS sopra i nostri stampi negativi.

Questo processo richiede tipicamente circa 30 minuti. Mentre i nostri stampi negativi sono sottoposti a degasaggio, possiamo pulire i substrati di vetro di 22 per 22 millimetri, che diventeranno la sede finale di montaggio dei pad. Il primo passaggio di questo processo consiste nell'eliminare eventuali particelle di polvere utilizzando azoto compresso.

Esponiamo le lamelle di vetro a un plasma gassoso, che carbonizzerà la superficie e la renderà più adesiva al PMS, che attaccheremo in seguito. Dopo aver lasciato il primo strato di PDMS a contatto con le DGA per circa 30 minuti e aver attivato le lamelle di vetro mediante plasma gassoso, possiamo rimuovere il nostro stampo e mettere a contatto la superficie superiore delle lamelle di vetro, precedentemente esposta al plasma gassoso, con lo strato di PDMS posto sopra gli stampi negativi. Di solito è utile far toccare prima un bordo della lamella di vetro al PDMS, per poi permettere al resto della lamella di adagiarsi in modo uniforme, in modo che il PDMS si espanda in forma laminare.

Questo aiuta a ridurre le bolle introdotte nel film di PDMS. A questo punto, possiamo premere delicatamente sulla superficie superiore del cover glass con le pinzette per espellere l'eccesso di PDMS e spostare il cover glass contro la croce di PDMS al centro del modello. Questo impedirà al cover glass di muoversi durante la polimerizzazione del PDMS.

Ripetiamo questa procedura per gli altri substrati. A questo punto, possiamo trasferire l'intero stampo in forno e cuocere a 110 gradi Celsius per 22 ore. Dopo aver lasciato raffreddare l'intero assemblaggio alla temperatura ambiente, possiamo quindi rimuovere i nostri substrati, capovolgerli ed estrarre con cura lo stampo negativo dallo slip di copertura in vetro.

È importante eseguire questa operazione lentamente e in modo uniforme per evitare di schiacciare i perni o strapparli dal substrato di vetro. Possiamo osservare che, dopo aver rimosso il calco negativo, otteniamo un reticolo di mensole che riproduce con precisione il modello in silicio, ma che ora sono realizzate in un elastomero flessibile in PDMS. Bene, a questo punto vi abbiamo illustrato come generiamo il modello in silicio dei nostri substrati Emad.

Successivamente, abbiamo utilizzato un processo di stampaggio per generare una replica esatta mediante il polimero elastomerico A-P-D-M-S, in modo che le cantilever siano ora flessibili, permettendo alla cellula di espandersi, contrarsi e deflettere le cantilever nel processo. A questo punto, i nostri substrati sono pronti per essere processati per la coltura cellulare. Ora che abbiamo visto come fabbricare e replicare gli stampi per produrre gli eds, eseguiremo alcuni ulteriori passaggi per rendere funzionale l'EDS, in modo da poter coltivare le cellule e analizzare successivamente le forze di trazione.

Ma prima di farlo, dobbiamo compiere tre azioni. Dobbiamo rendere le punte dei pali adesive alle cellule. In secondo luogo, dobbiamo etichettare fluorescentemente il PDMS per facilitare la visualizzazione e l'analisi delle deflessioni dei pali.

E terzo, dobbiamo rendere le pareti laterali dei micropilastri e la loro base non adesive alle cellule, in modo che le forze di trazione vengano esercitate soltanto alle estremità dei micropilastri. Vedremo nei prossimi minuti come questi passaggi vengano eseguiti mediante una strategia basata sulla microstampa per contatto. Ma prima, il passo successivo consiste nel rimuovere l'eccesso di P-D-S-P-D-M-S dagli eds.

Come dicevo, il primo passo consiste nel prendere il substrato EDS, che West vi ha appena mostrato come generare e rifilare. L'eccesso di PDMS risultante dalla polimerizzazione della coprioggetto in vetro contro lo stampo negativo va rimosso utilizzando una lametta affilata. Per eliminare l'eccesso di PDMS, posizionate la lametta verticalmente sul substrato lungo il bordo dei pilastri e poi raschiate via il materiale in eccesso.

E puoi usare un dito per tenere ferma la lamellina in modo che non si sposti. Quello che otteniamo alla fine è un substrato di M pad privo di detriti ed facilmente accessibile. Per il passaggio successivo, dobbiamo effettuare una stampa per microcontatto delle MPA per rendere le punte dei perni adesive.

Per fare ciò, dobbiamo prima generare dei timbri, e questo processo è molto semplice. Mescoliamo semplicemente il PDMS in un rapporto da uno a 30 a uno, invece che in un rapporto da 10 a uno. Versiamo il composto in una piastra di Petri in modo che l'altezza del PDMS sia di circa un centimetro.

Lasciarlo degassare, ovvero permettere alle bolle di risalire in superficie nel PDMS e far avvenire la reazione di reticolazione in forno a 60 gradi per un'ora. Dopo aver rimosso la piastra dal forno e averla lasciata raffreddare, sono ora pronto per ritagliare i timbri. Quindi, ancora una volta con lo stesso tipo di lama da rasatura, tagliare semplicemente premendo verticalmente verso il basso nel PDMS fino a quando non si entra in contatto con il fondo della piastra di Petri.

Ora, l'orientamento del timbro è un aspetto a cui dobbiamo prestare attenzione. La superficie del timbro sarà il lato del PDMS che è stato colato contro il fondo della piastra di Petri, in modo che rimanga piatto. Quindi, in questo grande quadrato di PDMS che ho ritagliato, la superficie del timbro è ora rivolta verso l'alto.

Ora questo stampo è molto più grande dei pad M, quindi lo ridurrò alle dimensioni di un singolo pad M tagliandolo con la lametta, poiché è molto difficile individuare ad occhio l'orientamento corretto dello stampo; pertanto, realizzerò una piccola tacca su quello che sarà il retro dello stampo, ossia il lato non frontale, proprio come questo. A questo punto posso rimuovere lo stampo dal blocco più grande. Ora ho uno stampo A-P-D-M-S pronto per il passaggio successivo.

Vogliamo pulire i timbri in PDMS. È molto probabile che durante il taglio si sia depositata sui timbri in PDMS della polvere atmosferica. Questo processo consiste nel posizionare il numero desiderato di timbri in PDMS in questa capsula di cristallizzazione e nel riempire la capsula con etanolo al 100%.

Aggiungere quindi etanolo in quantità sufficiente a coprire la superficie dei timbri, ma la quantità esatta di etanolo aggiunta non è importante. Successivamente, posizionare il disco di cristallizzazione in un agitatore e sottoporre i timbri a sonificazione per cinque minuti. Trascorsi i cinque minuti, si procederà a sterilizzare completamente i timbri ed eseguire il resto della stampa per microcontatto, ovvero la funzionalizzazione dei pad M, in un armadio sterile per colture tessutali.

Ora siamo nella cappa a flusso laminare dove possiamo completare la sterilizzazione dei timbri. Per fare ciò, preleviamo i timbri dalla capsula di cristallizzazione, li immergiamo in una capsula piena di etanolo per rimuovere eventuali residui rimanenti e infine li immergiamo in una capsula con acqua per eliminare l'etanolo. Quindi, con un flusso di azoto, asciughiamo i timbri fino a quando non restano più gocce visibili.

Quindi, il passo successivo consiste nell'inchiostrare i timbri con una soluzione proteica. La soluzione proteica utilizzata è costituita da 50 microgrammi per ml di fibrina in acqua DEI. Prelevare semplicemente una quantità della soluzione proteica con la pipetta e depositare delle gocce della soluzione sulla superficie del timbro.

È necessario fare ciò posizionando piccole gocce sul bordo della superficie del timbro. Innanzitutto, ripetere questa operazione per tutti i timbri che si intende utilizzare e avrei dovuto farlo in anticipo. Il passaggio successivo, dopo aver posizionato le gocce sui bordi di tutti i timbri, consiste nel collegare tali gocce e riempire la superficie del timbro con la soluzione proteica.

La ragione per cui abbiamo fatto ciò è che la soluzione proteica nelle gocce e così via al di sotto delle gocce rende la superficie del timbro idrofila, facilitando la diffusione della proteina della matrice extracellulare. Quindi, ripetere nuovamente questa operazione per tutti i timbri che si stanno utilizzando. Ora che abbiamo distribuito la soluzione proteica sulla faccia dei timbri, l'ultimo passaggio nella preparazione dei timbri consiste nell'assicurarsi che i bordi siano coperti. Per fare ciò, è sufficiente inclinare una pipetta e farla scorrere lungo la faccia del timbro in modo da entrare in contatto sia con l'angolo del timbro in PDMS sia con la soluzione proteica.

E ancora, ripetere questa operazione per tutti i bordi di tutti i timbri che si stanno inchiostrando. Ora che abbiamo terminato di inchiostrare i timbri, posizioniamoli lasciandoli nell'incubatore per colture cellulari per un'ora, in modo da favorire l'assorbimento completo della proteina sulla superficie del timbro. Dopo aver atteso un'ora per consentire alle proteine di adsorbirsi sulla superficie del timbro, è ora di risciacquarli con acqua e asciugarli con azoto.

Per fare ciò, preleviamo acqua sterile e la versiamo nella piastra contenente i timbri. È necessario fare attenzione a non versare l'acqua direttamente sulla superficie del timbro; se necessario, si può utilizzare una pipetta. La quantità esatta di acqua non è importante, purché il livello dell'acqua superi quello della soluzione proteica.

Dopo di ciò, utilizzando pinzette sterili, prendere un timbro, immergerlo in una nuova capsula di Petri contenente acqua e asciugarlo delicatamente con azoto. Saprete nuovamente che è asciutto quando non vedrete più goccioline di soluzione proteica sul timbro. Ripetere questa procedura per tutti i timbri che si stanno processando uno alla volta.

Ora che abbiamo risciacquato e asciugato i timbri, è il momento di attivare i substrati mpad trattandoli con ozono UV. Per sette minuti, rimuovo il coperchio della piastra di Petri, dal di sopra della piastra. Poiché il polistirene assorbe le radiazioni UV, successivamente pongo la piastra all'interno del trattatore a ozono UV, chiudo il cassetto, imposto il tempo su sette minuti e avvio il processo.

Ora siamo tornati nella cappa per colture cellulari ed è il momento di applicare i substrati mpad, che sono stati appena trattati con ozono UV. Per farlo, sollevare i timbri risciacquati e asciutti con una pinzetta. È possibile manipolare i timbri dai lati, ma non toccare la superficie del timbro.

Si desidera regolare il timbro nella pinzetta in modo che il lato proteico sia accessibile. Successivamente si capovolgono le pinzette, tenendo presente che il lato proteico è rivolto verso il basso, e si porta lentamente il timbro a contatto con l'eds. I timbri da uno a trenta sono piuttosto appiccicosi, quindi potrebbe essere necessario utilizzare una seconda coppia di pinzette per staccare il timbro dalle pinzette.

È possibile lasciar cadere il timbro da un'altezza compresa tra circa due millimetri e circa otto millimetri sugli emeds. Successivamente, inclinare verso l'alto la piastra degli emeds e premere delicatamente con una pinzetta per creare il contatto tra il timbro e gli eds. Si capirà che il contatto è stato stabilito in uno dei due modi seguenti.

Il primo metodo consiste nell'osservare la superficie dell'ED attraverso il lato del timbro. Questo può essere difficile da vedere attraverso la telecamera, ma ad occhio nudo è possibile vedere chiaramente che il timbro entra in contatto con la superficie osservandola lateralmente attraverso il timbro. Il secondo metodo per verificare il contatto, utilizzando la p, è quello di estrarre la piastra di Petri dalla cappa a flusso laminare tenendo chiuso il coperchio e osservarla al microscopio invertito.

Visualizzando i modelli di interferenza al microscopio, dovreste essere in grado di determinare quando, e se, il timbro è a contatto con l'eds. Una volta stabilito il contatto, il timbro deve semplicemente rimanere a contatto con questo, ovvero con il substrato ed, per qualche secondo. È quindi il momento di rimuovere il timbro.

Per fare ciò, piegare verso il basso gli Eds con una pinzetta ed eseguire in un unico movimento fluido il distacco del timbro. Assicurarsi di tenere traccia di quali Eds sono stati timbrati e di quali timbri sono già stati utilizzati in precedenza. Ripetere questa procedura una volta per ogni EMPA, per ciascun substrato che si desidera utilizzare.

Ora che abbiamo stampato le EMPA, il prossimo passaggio consiste nel sterilizzarle e successivamente incubarle in un colorante lipofilico chiamato dye eye. Dai è una molecola lipofilica marcata in modo fluorescente, che diffonde nel PDMS nel corso di un periodo di tempo prestabilito, permettendoci di visualizzare le deflessioni delle post sotto il microscopio. Quindi, prenderò ogni singolo substrato empa uno alla volta e lo immergerò in etanolo al 100%, etanolo al 70%, acqua deionizzata, acqua deionizzata, acqua deionizzata, acqua deionizzata.

E infine, una soluzione di dii a cinque microgrammi per millilitro. La soluzione di dii è fluorescente, quindi per ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambiente e prevenire la fotodegradazione, copriamo le piastre con carta d'alluminio mentre incubano nell'incubatore per colture cellulari per un'ora. Ora che è trascorsa un'ora di incubazione dei tamponi EM nella soluzione di DAI, possiamo rimuovere la carta d'alluminio e sciacquare via la soluzione di DAI.

Sciacquiamo il tutto eseguendo tre immersioni consecutive in acqua sterilizzata e, infine, immergiamo in una soluzione di F1 27 allo 0,2%. Ciò corrisponde allo 0,2% peso/volume. Durante tutti i passaggi di immersione, è importante ridurre al minimo il tempo in cui i cuscinetti EM sono esposti all'aria. Questo per prevenire danni ai substrati ED e, in particolare, impedire che due micropilastri collassino l'uno sull'altro.

F1 27 allo 0,2% è un copolimero a tre blocchi costituito da domini idrofili e idrofobi. Si sa che il dominio idrofilo resiste all'assorbimento delle proteine e quindi all'adesione cellulare, mentre il dominio idrofobo si lega al PDMS idrofobo. Pertanto, quando il PDMS viene immerso in F1 27, quest'ultimo si lega al PDMS e respinge l'adesione cellulare.

Dopo un'ora di incubazione in F1 27 in una piastra di Petri coperta con carta d'alluminio, è possibile rimuovere l'F1 27 mediante immersioni sequenziali in acqua sterile, acqua sterile e PBS. Dopo l'immersione in PBS e la rimozione completa del prodotto F1 27, i substrati eds possono essere immersi nella soluzione di coltura cellulare scelta. La soluzione di coltura cellulare in cui ho appena immerso le EMPAs può contenere siero e/o altri fattori di crescita e/o supplementi come penicillina e streptomicina.

Tutti questi ingredienti sono completamente compatibili con i trattamenti EMPAs. Ora il passaggio successivo, una volta che gli eds sono stati immersi nella soluzione di coltura cellulare, è quello di seminare le cellule di interesse sugli eds. Per questa particolare configurazione sperimentale, seminerò cellule endoteliali aortiche polmonari bovine in tre piastre diverse.

Il motivo per cui utilizzo tre piatti diversi è che tratterò due dei piatti con inibitori della tactilità noti, al fine di inibire le deflessioni dei pali, come potremo verificare in un momento successivo. Per seminare le cellule, prelevo semplicemente la mia sospensione cellulare, aspirando la quantità appropriata nella pipetta e aggiungendola goccia a goccia in ciascun piatto. Aggiungo un numero sufficiente di cellule in modo che, al momento dell'esecuzione del saggio per misurare le forze di trazione, le cellule siano presenti come cellule singole sugli eds.

La quantità da aggiungere dipenderà dalla superficie di distribuzione e dal tasso di crescita delle cellule specifiche. Di solito si seminano da 1500 a 5000 cellule per centimetro quadrato di substrato. Dopo aver terminato la semina delle cellule o la modifica della sospensione cellulare, aggiungere goccia a goccia al terreno e agitare delicatamente la coltura avanti e indietro diverse volte in direzioni ortogonali per mescolare la sospensione cellulare nella piastra di coltura.

Ripetere questo processo per tutti i substrati che si stanno utilizzando. Immediatamente dopo la semina delle cellule, posizionarle in un incubatore a 37 gradi con un livello appropriato di anidride carbonica per tamponare il pH e il mezzo di coltura cellulare. Due ore, circa due ore dopo la semina delle cellule, è appropriato lavare le cellule trasferendo i substrati da una piastra di mezzo a una piastra fresca contenente lo stesso mezzo di coltura cellulare.

Il motivo di questo risciacquo è che la maggior parte delle cellule avrà già iniziato a espandersi e avrà raggiunto quasi la loro area finale di espansione entro due ore. Risciacquando le cellule, ovvero i substrati, si eliminano tutte le cellule in sospensione dal mezzo di coltura cellulare. In questo modo, solo le cellule che si sono attaccate all'EDS e che hanno iniziato il processo di espansione saranno visibili nel saggio finale per le forze di trazione.

Un saggio che possiamo eseguire con cellule coltivate su MPAs è l'acquisizione di immagini in time-lapse per esaminare quantitativamente la dinamica della contrattilità cellulare. In particolare, risulta interessante la dinamica della contrattilità cellulare in risposta a fattori solubili. Si sa che fattori solubili come composti biologici e composti sintetici possono aumentare, ridurre o avere effetti sconosciuti sulla contrattilità cellulare.

Per questo esperimento su cellule vive, utilizzeremo questo microscopio a fluorescenza episcopica invertito. Sul tavolo del microscopio, è stato installato un piccolo box incubatore collegato a un regolatore termico per mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Effettueremo l'acquisizione di immagini ad alta ingrandimento mediante un obiettivo plan APO da 60x.

Ora prepareremo il substrato d'impatto per l'acquisizione delle immagini. L'obiettivo da 60x che stiamo utilizzando per l'acquisizione ha una distanza di lavoro di 200 micron, molto più sottile rispetto allo spessore della piastra per colture cellulari in cui abbiamo seminato le cellule in precedenza. Pertanto, non possiamo, non possiamo acquisire immagini di cellule sugli impianti all'interno della piastra per colture cellulari.

Per risolvere questo problema, utilizziamo queste piastre con fondo in vetro. Ora trasferirò il substrato nella piastra con fondo in vetro capovolto, in modo che le cellule e le punte dei pali si trovino all'interfaccia con il fondo in vetro della piastra. In questo modo, quando viene posizionato sul microscopio, la distanza di lavoro tra le cellule e l'obiettivo è inferiore a 200 micrometri.

Ora siamo pronti per posizionare il campione su un microscopio per l'acquisizione delle immagini. Apro ora la camera dell'incubatore per cellule vive, inserisco il campione all'interno e richiudo il coperchio della camera d'incubazione. A questo punto, esaminerò il substrato alla ricerca di una cellula adatta.

Per l'acquisizione di immagini. Il modo più efficiente per farlo è utilizzare un obiettivo da 10x a contrasto di fase, che mi permetterà di osservare un campo più ampio del substrato e individuare una cellula più rapidamente. Il mio criterio per una buona cellula è che si tratti di una cellula singola.

Non dovrebbe toccare alcuna cellula adiacente e dovrebbe avere una dimensione media rispetto a tutte le altre cellule sul substrato; ho trovato una cellula adatta da osservare. La prossima cosa che farò è passare all'obiettivo 60x per osservare la cellula con un ingrandimento elevato. Per fare ciò, defocalizziamo l'obiettivo, in modo che non urti il palco durante la rotazione.

Durante la rotazione della torretta, aprire la camera ed eseguire una rotazione parziale dell'obiettivo da 60x; l'obiettivo da 60x è una lente ad immersione in olio, quindi è necessario posizionare una goccia di olio di immersione sull'obiettivo. Ora completeremo la rotazione della torretta per portare l'obiettivo da 60x in posizione. Chiuderemo quindi la camera dell'incubatore e rimetteremo a fuoco l'obiettivo per riportare le cellule a fuoco.

Dopo aver regolato con precisione la posizione e il fuoco della cellula, passerò alla telecamera CCD in modo da visualizzare in anteprima la cellula sullo schermo del computer e quindi avviare l'acquisizione di immagini in time-lapse. Per questo esperimento, raccoglierò sia immagini in contrasto di fase che immagini fluorescenti a intervalli di un minuto; l'acquisizione in time-lapse è quindi iniziata e la lascerò proseguire per 10 minuti o 10 fotogrammi. A questo punto, aggiungerò il siero, poiché sono trascorsi esattamente 10 minuti. In questo momento, aprirò la camera e aggiungerò il siero alla piastra per stimolare la contrattilità della cellula.

Il timer è ancora in esecuzione, quindi devo fare in fretta. Ora continueremo a effettuare l'acquisizione delle immagini della cellula per 30 minuti per seguire eventuali cambiamenti nella contrattilità. Una volta terminata l'acquisizione in time-lapse, le immagini possono essere sequenziate in un filmato da mostrare. Ecco due filmati delle immagini in fase e in fluorescenza.

A sinistra è mostrato un filmato in contrasto di fase di una cellula prevalentemente trasparente, delimitata in nero. La cellula si estende sulle punte di 20 micropilastri, che sono le strutture circolari disposte in un reticolo rettangolare. A destra è mostrato un filmato in fluorescenza della stessa cellula, ma sono visibili soltanto i micropilastri.

Se riproduco questi filmati, vedrete che i pali collegati alla cellula sono inizialmente deboli, leggermente deflessi e si discostano molto poco dal reticolo rettangolare. Verso la metà del filmato, ho aggiunto siero al mezzo. Il siero stimola la cellula ad aumentare la contrattilità.

Mentre la cellula esercita forze di trazione maggiori sui micropilastri sottostanti, i pilastri lungo il perimetro della cellula iniziano a deflettere verso l'interno. Nel filmato fluorescente, si osserva ora una significativa deviazione dei pilastri rispetto alle loro posizioni nel reticolo rettangolare. Come descriverò in seguito, lo spostamento delle posizioni di questi pilastri nelle immagini può essere utilizzato per analizzare le forze di trazione esercitate da questa cellula.

In precedenza, abbiamo visto come abbiamo generato i substrati mpad e come li funzionalizziamo per coltivare le cellule. Ora avrete notato che ho posizionato i substrati mpad finiti in tre diverse piastre per colture cellulari. Le cellule sono cresciute durante la notte, e ora quello che farò è trattare ciascuna piastra per colture cellulari con un diverso agente solubile che modula la contrattilità in un modo noto.

Successivamente, possiamo misurare in modo quantitativo le forze di trazione che si generano dopo aver fissato le cellule per 30 minuti. Dopo aver aggiunto i fattori solubili 30 minuti dopo l'aggiunta degli inibitori della contrattilità, è ora il momento di fissare le cellule con paraformaldeide per bloccare lo stato attuale delle forze di trazione. Per fare ciò, è importante utilizzare paraformaldeide contenente calcio e magnesio, e usiamo paraformaldeide a una percentuale volumetrica del 3,7%. Il metodo per immergere i substrati nella paraformaldeide, scusate, è lo stesso metodo utilizzato per immergere i substrati nei diversi RIN durante la funzionalizzazione.

Cioè, è importante non far asciugare i substrati poiché ciò potrebbe portare al collasso post-trasferimento. Dopo aver trasferito i substrati, li lascio incubare nell'aldeide paraformica per 20 minuti. Trascorsi i 20 minuti, rimuoviamo i substrati dall'aldeide paraformica; ora che le cellule sono state fissate, possiamo procedere con l'immunomarcatura standard di questi campioni.

A tale scopo, posizioniamo i substrati con la faccia rivolta verso l'alto su param e aggiungiamo con la pipetta una quantità sufficiente di PBS per coprire il substrato e mantenerlo al di sotto del PBS. Successivamente, laviamo il substrato tre volte con PBS per rimuovere qualsiasi traccia di paraformaldeide che potrebbe essere rimasta nella coltura. Dopo aver lavato il substrato tre volte con PBS, possiamo trasferirlo per la successiva immunoistochimica.

Questo viene fatto manipolando il substrato con una pinzetta e capovolgendolo nel primo passaggio della colorazione immunoistochimica, utilizzando un agente di permeabilizzazione. In questo caso, stiamo usando Triton X 0,2% in PBS. Tuttavia, l'utente può utilizzare qualsiasi agente di permeabilizzazione ritenuto più appropriato per le proprie esigenze.

Ripetiamo questa procedura per tutti i nostri substrati ed è così che gestiamo i substrati durante il processo di colorazione immunoistochimica. Dopo la colorazione immunoistochimica, i substrati vengono montati su un normale vetrino di vetro di dimensioni una pollice per tre pollici, che può quindi essere analizzato su qualsiasi microscopio a fluorescenza episcopica, sia esso invertito o dritto. Analizzando i campioni al microscopio confocale, possiamo focalizzare la parte inferiore dei micropilastri per ottenere le posizioni non deflesse, ovvero nulle.

Possiamo quindi mettere a fuoco fino alle punte dei pali, acquisire un'altra immagine dei pali e, confrontando l'immagine superiore con quella inferiore, misurare le deflessioni dei pali e calcolare le forze di trazione delle cellule, ovvero le forze generate dalle cellule per produrre tali deflessioni. Eseguendo questo procedimento per molte cellule diverse in diverse condizioni, possiamo quindi confrontare le forze di trazione generate nelle diverse condizioni. Ora che abbiamo raccolto immagini sia di cellule vive che fissate, il nostro passo successivo consiste nel misurare la deflessione, nonché le forze di trazione all'interno delle cellule.

Per fare ciò, abbiamo scritto un programma informatico in matlab. Queste sono le tre immagini che utilizzeremo in questa analisi. La prima immagine è un'immagine in fase della cellula.

È utile per identificare la posizione della cellula. La seconda immagine è un'immagine fluorescente delle sommità dei pali. Utilizziamo questa immagine per localizzare le posizioni dei pali alle loro estremità.

Come si può notare, alcuni di questi pali sono deviati e si discostano dal reticolo rettangolare in cui si trovano la maggior parte dei pali, come ad esempio questo palo. E questo palo. La terza immagine che utilizzeremo è l'immagine di base, che cattura la posizione dei pali in un piano focale che attraversa la loro base.

A questo livello, sia i perni deviati che quelli non deviati devono trovarsi nella loro posizione di riposo, cioè nelle posizioni non deviate. Nel reticolo rettangolare, si può osservare che i perni deviati nella seconda immagine alla base si trovano nella loro posizione FL. Questa immagine viene utilizzata per determinare la posizione del perno nella sua posizione sotto-riflessa.

Successivamente, carichiamo il programma MATLAB, che ci chiederà di caricare queste tre immagini. Assegnare un nome al file. Si osserva l'immagine di fase.

Tracceremo un riquadro intorno all'indicazione della posizione della cellula, in modo che il programma sappia quali pali analizzare. Il programma esegue quindi l'analisi dell'intensità, la sogliatura e la izzazione dell'immagine ritagliata per determinare le coordinate OID dei pali. A sinistra si trovano le immagini izzate dei pali provenienti dall'immagine superiore, mentre a destra sono presenti le immagini izzate degli stessi pali provenienti dall'immagine di base.

Dopo aver ottenuto i dati dei pali, le coordinate OID, il programma può quindi determinare i vettori di spostamento tra la punta e la base di ciascun palo. Questi vettori di spostamento dei pali possono essere convertiti in vettori di forza moltiplicandoli per la costante elastica del palo. Possiamo analizzare queste forze cellulari in diversi modi, ad esempio come forza media per cellula o forza media per palo.

Un risultato utile è un grafico a frecce con cui possiamo visualizzare la distribuzione spaziale delle forze. Questa è la cellula che abbiamo appena analizzato e si possono vedere frecce gialle sovrapposte sui pali che corrispondono all'entità della forza e puntano nella direzione della forza stessa. Ripetendo questo processo di analisi delle immagini per sequenze di immagini come quelle necessarie per il nostro filmato in time-lapse, possiamo generare una sequenza temporale.

Ecco un filmato della cellula che è stata stimolata con siero. Come si può vedere, proprio quando il siero è stato aggiunto, la cellula ha aumentato la contrattilità e ha deflesso ulteriormente i pali. Inoltre, possiamo quantificare le forze per un numero maggiore di cellule sottoposte a diverse condizioni e successivamente fissate e colorate, come illustrato da questi grafici a freccia che mostrano una cellula trattata con un composto di controllo rispetto a cellule trattate con inibitori della contrattilità.

Come puoi. Come puoi vedere, i vettori di forza sulla cellula nel caso di controllo sono maggiori in lunghezza e in grandezza rispetto ai vettori di forza nei due casi in cui sono stati utilizzati gli inibitori della contrattilità; abbiamo affrontato molto materiale per descrivere il substrato, dalla microfabbricazione alla preparazione del campione, fino all'esperimento e all'analisi, per dimostrare la versatilità di questi substrati.

Abbiamo descritto due diversi saggi, l'immagine di cellule vive e il saggio su campioni fissati, ed abbiamo analizzato cellule ottenute da entrambi questi saggi mostrando grafici a frecce e filmati a frecce. Con questo potente strumento, è possibile effettuare una varietà di analisi spaziali e temporali della contrattilità cellulare. Come avete visto, questo metodo attinge a molte discipline diverse, tra cui la microfabbricazione, la biologia cellulare di base, la scienza delle superfici, l'analisi e l'elaborazione delle immagini e molte altre.

E proprio perché il suo metodo si basa su diverse tecniche ingegneristiche, parametri come la geometria dei micropilastri, i fattori solubili indotti e i metodi per analizzare le deflessioni dei pilastri possono essere personalizzati in base alle esigenze dell'utente. Speriamo che la dimostrazione visiva di questo metodo, che abbiamo delineato negli ultimi 20, 30 minuti, possa essere utilizzata come punto di partenza per ulteriori e più approfondite analisi sulla regolazione, sulle conseguenze funzionali e sulla generazione delle forze di attrazione cellulare.