Microfabbricazione post-Array-Detector (mPADs): un approccio per isolare le forze meccaniche

Ciao, sono Nathan Snia Decky e con me oggi c'è Wes Ligan e Robbie Desai e Mike Yang. E noi veniamo dal laboratorio di Chris Chen qui all'Università della Pennsylvania. In questo video presenteremo il nostro approccio per misurare le forze di attrazione cellulare utilizzando una serie di perni microfabbricati.

Le forze di trazione sono generate attraverso le interazioni tra miosina e attoni e svolgono un ruolo importante nella nostra fisiologia. Durante lo sviluppo, consentono alle cellule di spostarsi da un luogo all'altro per formare le prime strutture del nostro tessuto. E aiutano anche nel processo di guarigione perché sono necessari per la chiusura delle ferite o la migrazione e la strisciata dei leucociti attraverso il nostro corpo.

Ma purtroppo queste stesse forze possono essere dannose per la nostra salute in caso di cancro, metastasi o crescita vascolare verso un tumore. Quindi ci sono pochissimi metodi che possono effettivamente misurare queste forze di trazione in modo quantitativo, e specialmente su micro e nanoscala di singole cellule. La maggior parte dei metodi comuni per studiare le cellule in vitro sono stati con piastre con fondo di vetro o piastre di polistirolo, ma questi sono substrati molto rigidi e non lo sono, non ci permettono di misurare fisicamente le forze di trazione e le diffamazioni che una cellula causa.

E quindi è stato molto difficile capire i meccanismi sottostanti alle forze di trazione senza un qualche tipo di lettura fisica. E così nel laboratorio di Chris Chen abbiamo una tecnica che ci permette di superare questi limiti. Il nostro metodo si basa su una serie verticale di cantilever flessibili, la cui rigidità e scala dimensionale sono tali che le singole celle si diffondono su più cantilever e le deviano nel processo.

Le dimensioni che utilizziamo più frequentemente sono tre micron di diametro, pali cilindrici di diametro, 10 micron di altezza con una spaziatura da centro a centro di nove micron e una matrice rettangolare. Tuttavia, queste dimensioni possono essere variate per adattarsi a una varietà di studi cellulari. Iniziamo con un master in silicio rigido che potete vedere qui e poi lo traduciamo in cantilever PDMS flessibili che vediamo qui.

Utilizzando questa tecnica possiamo misurare le deflessioni dei singoli cantilever al microscopio e recuperare le forze di trazione cellulare con l'entità e la direzione necessarie per generare tali deflessioni. Abbiamo trasformato questi substrati in pad M per rivelatori micro post array e in questo video vi mostreremo come fabbricare i pad M, iniziando con il master in silicone attraverso la replicazione PDMS, e infine al calcolo della modulazione e della contrattilità cellulare. Ciao, eccoci qui nella camera bianca dei nostri laboratori.

Questa è una stanza priva di polvere e sensibile alla luce che ci permette di realizzare gli otto pali SU che fungeranno da master in silicio. Per prima cosa inizieremo con un wafer di silicio e con questo lo rivestiremo con SU eight photo resist, SU eight è un resist negativo ed è sensibile alla luce. Quindi, quando facciamo brillare la luce attraverso questa maschera fotografica, farà sì che la luce modelli i micro pali e quindi formi una struttura tridimensionale, che sarà quindi gli otto pali SU che poi proiettiamo in PDMS.

Quindi, dopo aver eseguito tutta la nostra lavorazione, il wafer avrà questo aspetto, che è dove abbiamo il micro pilastro, le micro strutture dei pali già fabbricate nel wafer. Quindi, per fare i master, iniziamo con un wafer di silicio nudo e questo è stato pulito con un trattamento con ozono per sette minuti e abbiamo anche disidratato questo wafer per 30 minuti a 120 gradi Celsius. Gireremo SU otto 2002 su questo per formare uno strato di base molto sottile per i pali.

Quindi, poiché faremo girare l'otto SU, indosserò una maschera antigas, ricaricherò il wafer in questo supporto qui, rispolvererò la polvere che potrebbe essere lì, lo posizionerò sullo spinner, controlleremo per assicurarci che sia centrato E poi procederemo a versare l'otto SU 2002 sopra questo. E poi andremo avanti e faremo girare l'ostia. Li mettiamo poi sulla piastra calda, la cottura morbida.

Lo facciamo per un minuto dopo. Quindi lo prendiamo e lo trasferiamo sulla piastra riscaldante a 95 gradi. E lo facciamo per due minuti.

E quando avrà finito, prenderemo questo ora e andremo a fare l'esposizione alle inondazioni nell'allineatore della maschera. Ok, quindi abbiamo appena filato SU otto, il primo strato di SU otto su questo wafer, e ora dobbiamo allagare l'esposizione dell'intero wafer per creare il primo strato di base per i micro post. Quindi dobbiamo dare a questo 70 millijoule di esposizione.

Quindi dobbiamo quindi misurare l'intensità effettiva della luce nel nostro allineatore a maschera. Quindi carichiamo il misuratore nel peso nell'allineatore della maschera. Poi lo esponiamo con la luce.

Questa è la luce UV qui. Carichiamo il wafer di silicone sull'allineatore della maschera, lo posizioniamo nell'allineatore della maschera. E questa volta non abbiamo una maschera, quindi in questo modo possiamo esporre l'intero film.

Mettiamo l'otturatore e andiamo avanti e aumentiamo un minuto di esposizione e andiamo avanti e esponiamo. Quindi, dopo un minuto il sistema è pronto, possiamo estrarre il wafer. E ora dobbiamo fare la cottura post-esposizione.

Quindi abbiamo appena esposto questo wafer e ora aggiungeremo calore per causare la reazione di reticolazione per questo primo rivestimento di SU otto. Quindi lo posizioniamo su una piastra riscaldante a 65 gradi per un minuto e poi trasferiamo su una piastra riscaldante a 95 gradi per due minuti. Dopo il processo di due minuti, spegniamo la piastra calda e lasciamo raffreddare il wafer a temperatura ambiente, il che richiede circa 30 minuti.

Quindi abbiamo fatto girare il nostro secondo strato di otto SU su questo wafer. E ora dobbiamo effettivamente esporre questo attraverso la maschera fotografica. Questa volta utilizzeremo un filtro UV per bloccare la luce UV profonda.

Questo è un vetro ottico Hoya che puoi ottenere, ma questa volta dobbiamo misurare di nuovo l'intensità. Quindi useremo il nostro esposimetro o useremo il filtro in cima per misurare l'intensità che è stata filtrata. E poi caricheremo la maschera nell'allineatore della maschera.

Questo interruttore crea il vuoto che mantiene la maschera in posizione. Lo inseriremo quindi nell'allineatore della maschera. Posizioneremo quindi il filtro sopra e poi caricheremo il nostro wafer

Vogliamo assicurarci che ci sia un buon contatto, quindi lo solleviamo in contatto e poi inizieremo l'esposizione Dopo l'esposizione, toglieremo il nostro wafer dall'allineatore della maschera. Quindi ora abbiamo aree che sono state esposte in modo selettivo. Lo porteremo al forno, alle piastre calde per fare la cottura post-esposizione su di esso.

Quindi abbiamo appena fatto The po, la cottura finale post-esposizione, e ora svilupperemo questo wafer in modo da poter effettivamente ottenere le strutture tridimensionali. Quello che faremo è lavare questo, sviluppare questo in P-G-M-E-A, che laverà via l'otto SU non esposto. Quindi iniziamo prima in un piatto di P-G-M-E-A e facciamo sedere l'ostia qui per due minuti con una leggera agitazione.

Quindi lascerò perdere questo per due minuti. Quindi passiamo a un secondo piatto di P-G-M-E-A. Questo rimuoverà quel P-G-M-E-A saturo con SU otto.

Dopo 10 secondi lo porteremo in IPA. Questo lava via il P-G-M-E-A. Lo mettiamo qui per 20 secondi, di nuovo con una leggera agitazione.

E poi in questo momento abbiamo le strutture dei pali autoportanti. Quindi lo metteremo nell'esano, che ha una bassa tensione superficiale. Laveremo per cinque secondi in uno e poi due esani, e poi saremo pronti per asciugarlo con il phon.

Quindi abbiamo appena sviluppato il wafer e ora lo metteremo su una piastra calda e aumenteremo lentamente la temperatura fino a uno 50. E quello che succede è che questa temperatura più alta collega ulteriormente l'otto SU per renderlo strutturalmente più rigido e lo lasciamo su questa piastra calda durante la notte. Quindi, dalle 14 alle 20 ore e dopo, spegneremo la piastra calda e la lasceremo raffreddare di nuovo a temperatura ambiente.

Quindi quello che dobbiamo fare è ridurre questo wafer a una dimensione più piccola. Fondamentalmente vogliamo tagliare questo wafer di silicio e creare un piccolo chip di questo modello interno. E assomiglierà a questa struttura dove useranno la resina epossidica.

E incolleremo quel chip su un vetrino in questo modo. E questo fornisce un supporto strutturale. Quindi, tagliare a dadini un wafer, è una sorta di arte, ma quello che puoi fare è fondamentalmente usare un graffietto a diamante e iniziare da un solo bordo.

E a causa dei piani di cristallo, hai appena messo una piccola tacca ora che ha creato una frattura, che posso quindi toccare con questo strumento, possiamo staccarla e possiamo quindi fare più tagli qui fino a ottenere una piccola struttura come questa. E poi si posiziona rapidamente il chip di silicio sul vetro e lo si monta in posizione. E lasci che sia così.

E così, dopo aver finito, avrete un, avrete un dispositivo simile a questo. Quindi abbiamo montato il master in silicone su questo vetrino e ora gli daremo un rivestimento di floy, che aiuterà a rilasciare questa struttura dal PDMS in seguito. Quindi metteremo il chip in questo essiccato e poi prenderemo alcune goccioline di questo tri Chloro Siling e ne metteremo alcune gocce nell'essiccato.

Lo facciamo all'interno della cappa perché questo ha un sottoprodotto del gas cloridrico idro, che è piuttosto duro. Vai avanti e chiudi il coperchio, attaccalo al vuoto e poi andiamo avanti e lasciamo riposare questo dal vuoto acceso e lasciamo che questo deposito durante la notte per ottenere un bel rivestimento sull'intero wafer di silicone. Ciao, sono Wesley Ligan.

Sono uno studente laureato nel laboratorio di Christopher Chen. A questo punto, Nate ti ha mostrato come creare un master in silicone per i nostri substrati ED. Tuttavia, prima di poter utilizzare questo strumento per misurare la contrattilità cellulare è necessario replicare le strutture fotografiche rigide utilizzando un polimero siliconico elastomerico.

Il nostro primo compito è generare un modello negativo del master in silicone che abbiamo fabbricato in precedenza. Lo facciamo utilizzando un elastomero siliconico chiamato PDMS o Polimetilsloane per il nostro polimero PDMS. Aggiungiamo ora un rapporto di uno a 10 di agente indurente.

Una volta pesata la soluzione, è necessario miscelare accuratamente il polimero PDMS e l'agente cross-leaking. Questa miscelazione introduce ovviamente molte bolle d'aria nella nostra soluzione. Quindi a questo punto, è necessario coprirlo e degassarlo nell'essiccato sottovuoto.

Una volta che il PDMS è completamente degassato e tutte le bolle sono salite in superficie e sono scoppiate, possiamo rimuoverlo dall'essiccato sottovuoto. Ora possiamo utilizzare questa miscela di PDMS e agente reticolante per generare uno stampo negativo del nostro master in silicio. E per fare questo, usiamo una tortiera e posizioniamo il nostro master in silicone montato al centro di essa.

Quindi versiamo con cura la soluzione polimerica DGA nel piatto sopra il wafer di silicio cercando di evitare la formazione di ulteriori bolle. In genere si cerca di versare il polimero di circa un quarto di pollice di spessore. Si può notare che questo processo introduce inevitabilmente alcune bolle d'aria nella miscela.

Quindi ora mettiamo da parte questo piatto per circa 30 minuti per permettere alle bolle di salire in superficie e scoppiare. Possiamo vedere che dopo averlo lasciato riposare, ci sono ancora alcune bolle d'aria sulla superficie del PDMS. Tuttavia, poiché questi si trovano sulla superficie superiore, ora possiamo utilizzare una rapida esplosione di azoto per far scoppiare le bolle rimanenti.

Per reticolare completamente la soluzione PDMS e CROSSLINKER e generare un modello negativo rigido del nostro master in silicio, lo cuociamo a 110 gradi Celsius per 20 minuti. Possiamo vedere che c'è un sottile strato di PDMS sopra il substrato di silicone. E prima di poter staccare i due, è necessario prima tagliare via questo strato.

Quindi possiamo innestare questo strato superiore e staccarlo delicatamente dal substrato di silicio. A questo punto, possiamo invertire e staccare molto lentamente il substrato di silicio negativo, il substrato PDMS negativo lontano dal master in silicone. Ok, lo facciamo tenendo premuta un'estremità e staccando delicatamente il substrato PDMS.

Puoi vedere l'avanzamento anteriore mentre il substrato si stacca dal master in silicone. Ora che abbiamo generato lo stampo negativo A-P-D-M-S del nostro master in silicone, possiamo tagliarlo in quattro singoli stampi negativi per realizzare i substrati finali del pad. A questo punto è importante non toccare la parte superiore del substrato negativo con una pinza o con i guanti per evitare di danneggiare la superficie.

Quindi, a questo punto, abbiamo generato quattro modelli negativi individuali dal master in silicone costituiti da tre pozzetti di diametro micron, profondi nove micron. Al fine di rigenerare le superfici rialzate a sbalzo, possiamo fondere nuovamente su questi stampi negativi da un PDMS PDI utilizzando PDMS. Tuttavia, prima di farlo, è necessario prima rendere questi stampi negativi non adesivi rivestendoli con un fluoro.

Lo facciamo in una camera al plasma da cento watt a piena potenza per un minuto. Dopo aver permesso alla camera di pompare il ritorno sul plasma, questo genera un campo di ioni gassosi che incide la superficie superiore del PDMS e la rende più adesiva alle molecole di fluoro Cy Lane. Dopo aver rimosso gli stampi negativi dall'essiccato sottovuoto, puoi vedere qui che ciò che ci rimane è una serie di pozzetti profondi tre micron per 10 micron in uno strato PDMS non adesivo.

Al fine di rigenerare i cantilever verticali, che utilizziamo per i substrati mpad, è necessario rifondere questo utilizzando la nostra stessa miscela PDMS e questo ci lascerà con una serie positiva di cantilever elastomerici, che rispecchiano in modo identico il master in silicio che abbiamo fabbricato in precedenza. Il primo passo di questa procedura consiste nel trasferire i nostri stampi negativi non adesivi su una maschera di montaggio composta da strisce PDMS e un vetrino da microscopio in vetro. Il motivo di questo impianto diventerà chiaro nel prossimo passo.

A questo punto, possiamo depositare una piccola goccia della nostra stessa miscela 10 a uno di PDMS per reticolante già Degas sulla superficie superiore di ciascuno dei nostri stampi negativi. È necessaria solo una piccola quantità di PDMS in modo che non coli sul bordo degli stampi negativi. A questo punto.

Per distribuire più completamente il PDMS sulla superficie superiore degli stampi, possiamo afferrarne uno usando una pinza, capovolgerlo e portarlo a contatto con lo stampo adiacente distribuendolo accuratamente attorno al PDMS per coprire completamente l'intero substrato. Fare molta attenzione in questo passaggio a non introdurre ulteriori bolle nella parte superiore La soluzione PDMS può poi ripetere con gli altri due pozzetti, altri due stampi. Ora che abbiamo un rivestimento PDMS più uniforme su tutta la superficie superiore, possiamo posizionare questa maschera in un essiccante sottovuoto per rimuovere ulteriormente eventuali bolle che potrebbero essere intrappolate nella pellicola PDMS sopra i nostri stampi negativi.

Questo processo richiede in genere circa 30 minuti. Mentre i nostri stampi negativi sono in fase di degasaggio, possiamo pulire i substrati di vetro da 22 per 22 millimetri, che diventeranno il punto di montaggio finale per i cuscinetti. Il primo passo in questo processo consiste nel soffiare via eventuali particelle di polvere utilizzando azoto compresso.

Esporremo i vetri di copertura al plasma di gas, che incenerirà la superficie e la renderà più adesiva al PMS, a cui ci attaccheremo nel passaggio successivo. Dopo aver permesso lo strato superiore di PDMS ai DGA per circa 30 minuti e il plasma di attivare i vetrini di copertura, possiamo quindi rimuovere il nostro modello e portare la superficie superiore dei vetrini di copertura, che è stata esposta al plasma gassoso, a contatto con lo strato PDMS sopra gli stampi negativi. In genere è utile portare prima un bordo del vetrino a contatto con il PDMS e poi lasciare che il resto del vetrino si depositi in un SH in modo che il PDMS si diffonda in modo simile a un foglio.

Questo aiuta a ridurre le bolle introdotte nel film PDMS. A questo punto, possiamo premere delicatamente sulla superficie superiore del vetrino coprioggetto con le nostre pinze per spingere fuori il PDMS in eccesso e spingere il vetrino coprioggetti contro la croce PDMS al centro del modello. In questo modo si eviterà che il vetrino coprioggetto si muova durante l'indurimento del PDMS.

Ripetiamo questo per gli altri substrati. A questo punto, possiamo trasferire l'intera dima in forno e infornare a 110 gradi per 22 ore. Dopo aver lasciato raffreddare l'intero gruppo a temperatura ambiente, possiamo quindi rimuovere i nostri substrati, capovolgerli e staccare con cura lo stampo negativo dal vetrino di vetro.

È importante farlo lentamente e in modo uniforme per evitare di schiacciare i pali o strapparli dal substrato di vetro. Possiamo vedere che dopo aver staccato lo stampo negativo, ci rimane una serie di cantilever che imitano esattamente il Silicon Master, solo che ora sono dentro, sono costruiti con un elastomero PDMS flessibile. Ok, a questo punto vi abbiamo illustrato come generiamo il Silicon Master dei nostri substrati Emad.

Abbiamo quindi utilizzato un processo di stampaggio di replica per generare una replica esatta utilizzando il polimero elastomerico A-P-D-M-S in modo che i cantilever siano ora flessibili per consentire alla cella di diffondersi e contrarsi e deviare i cantilever nel processo. A questo punto, i nostri substrati sono pronti per la lavorazione per la coltura cellulare. Ora che abbiamo visto come fabbricare e replicare gli stampi per realizzare gli EDS, faremo qualche altro passaggio per rendere funzionale l'EDS in modo da poter coltivare noi stessi e successivamente analizzare le forze di trazione.

Ma prima di farlo, dobbiamo fare tre cose. Dobbiamo rendere le punte dei perni adesive alle celle. In secondo luogo, è necessario etichettare in modo fluorescente il PDMS in modo da facilitare la visualizzazione e l'analisi delle deflessioni dei pali.

E in terzo luogo, dobbiamo rendere le pareti laterali dei pali e la base dei pali non adesive alle celle in modo che le forze di trazione vengano esercitate solo sulle punte dei pali. Quindi vedremo come procedono questi passaggi tramite una strategia basata sulla micro contact printing nei minuti successivi. Ma prima, il passo successivo è quello di pulire l'eccesso di P-D-S-P-D-M-S dagli eds.

Quindi, come ho detto, il primo passo è prendere il substrato EDS, che West vi ha appena mostrato come generarlo e tagliarlo. L'eccesso di PDMS risultante dall'indurimento del vetrino di copertura contro lo stampo negativo e dall'utilizzo di un rivestimento affilato della lama di rasoio. Il PDMS in eccesso, lo si fa, mettendo la lama del rasoio verticalmente sul substrato sul bordo dei pilastri e poi raschiando via.

E puoi usare un dito per tenere il vetrino coprioggetto in posizione in modo che il vetrino coprioggetto non si muova. Quindi quello che otteniamo è un substrato di pad M che è stato ripulito dai detriti e quindi è facilmente accessibile. Quindi, per il passaggio successivo, dobbiamo micro contatto, stampare le MPA per rendere adesive le punte dei perni.

Per fare ciò, dobbiamo prima generare i francobolli e questo processo è molto semplice. Semplicemente mescoliamo il PDMS invece di un rapporto di 10 a uno, uno a 30 a uno. Versiamo una capsula di Petri in modo che l'altezza del PDMS sia di circa un centimetro.

Lascialo degassare. Cioè lasciare che le bolle salgano in cima al PDMS e polimerizzare la reazione di reticolazione in forno a 60 gradi per un'ora dopo aver tolto la pirofila dal forno e averla lasciata raffreddare, ora sono pronto per ritagliare i timbri. Quindi, di nuovo, con lo stesso tipo di lama di rasoio, è sufficiente tagliare premendo verticalmente verso il basso fino a quando non si entra in contatto con il fondo della capsula di Petri.

Ora l'orientamento del timbro è qualcosa a cui vogliamo prestare attenzione. La superficie del timbro sarà il lato del PDMS che è stato fuso contro il fondo della piastra di Petri in modo che rimanga piatto. Quindi, in questo grande quadrato di PDMS che ho ritagliato, la superficie del timbro è ora rivolta verso l'alto.

Ora questo timbro è molto più grande dei pad M, quindi lo taglierò di nuovo fino alle dimensioni di un singolo pad M tagliando con la lama del rasoio, perché è molto difficile dire l'orientamento corretto del timbro a occhio, metterò una piccola tacca in quello che sarà il retro del timbro che è il lato non frontale proprio così. E poi posso rimuovere il timbro dalla lastra più grande. E ora ho il timbro A-P-D-M-S per il prossimo passo.

Vogliamo pulire i timbri PDMS. Dal momento che è molto probabile che la polvere dell'atmosfera si sia depositata sui timbri PDMS mentre li stavo tagliando. Questo è un processo in cui inseriamo il numero desiderato di timbri PDMS in questa capsula di cristallizzazione e riempiamo la capsula di cristallizzazione con etanolo al 100%.

Quindi basta aggiungere abbastanza etanolo per coprire la faccia dei francobolli, ma l'esatta quantità di etanolo aggiunta non è importante. E poi posizionare il disco di cristallizzazione in un atomizzatore e sonicare i timbri per cinque minuti. Trascorsi i cinque minuti, finiremo di sterilizzare i timbri ed eseguiremo il resto della micro stampa a contatto, ovvero la funzionalizzazione dei tamponi M in una cappa sterile per coltura tissutale.

Ora ci troviamo nella cappa di coltura dei tessuti, dove possiamo finire di sterilizzare i timbri. Per fare questo, prendiamo i timbri dalla capsula di cristallizzazione, li immergiamo in una pirofila piena di etanolo per sciacquare via eventuali detriti rimanenti e infine li immergiamo in una ciotola d'acqua per sciacquare via l'etanolo. Noi quindi con un getto di azoto, asciughiamo i timbri fino a quando non rimangono più gocce visibili.

Quindi il passo successivo, dobbiamo inchiostrare i timbri con una soluzione proteica. La soluzione proteica che stiamo utilizzando è di 50 microgrammi per mil di fibrina nell'acqua DEI. È sufficiente raccogliere un po' della soluzione proteica nella pipetta e posizionare le gocce della soluzione proteica sulla faccia del timbro.

A tale scopo, posizionare delle piccole goccioline sul bordo della faccia del timbro. Per prima cosa, ripeti l'operazione per tutti i francobolli che utilizzerai e avrei dovuto farlo in anticipo. Quindi il passo successivo dopo aver posizionato i punti sui bordi di tutti i timbri è collegare quelle goccioline e riempire la soluzione proteica sulla faccia del timbro.

Il motivo per cui lo abbiamo fatto è perché la soluzione proteica nelle goccioline e le sos sotto le goccioline rendono la superficie del timbro idrofila, facilitando la diffusione della proteina della matrice extracellulare. Quindi, ripeti l'operazione per tutti i timbri che stai utilizzando ora che abbiamo distribuito la soluzione proteica sulla parte anteriore dei timbri, l'ultimo passo per inchiostrare i timbri è assicurarsi che i bordi siano coperti. Per fare ciò, è sufficiente inclinare una pipetta e farla scorrere lungo la faccia del timbro in modo da entrare in contatto sia con l'angolo del timbro PDMS che con la soluzione proteica.

E di nuovo, ripeti l'operazione per tutti i bordi di tutti i timbri che stai inchiostrando. Ora che abbiamo finito di inchiostrare i timbri, li abbiamo impostati, li lasciamo nella cappa di coltura tissutale per un'ora al fine di facilitare il completo assorbimento della proteina sulla faccia del timbro. Quindi, ora che abbiamo aspettato un'ora che le proteine arrivino nella loro riserva, vengano assorbite sulla superficie del timbro, ora è il momento di sciacquarle con acqua e asciugarle con azoto.

Per fare questo, prendiamo acqua sterile e versiamo l'acqua sterile nella piastra contenente i timbri. Fare attenzione a non versare l'acqua direttamente sulla faccia del timbro e se necessario è possibile utilizzare una pipetta. L'esatta quantità di acqua che hai avuto non è importante fintanto che porti il livello dell'acqua al di sopra della soluzione proteica.

Dopodiché, con una pinzetta sterile, prendi un timbro, immergilo in un nuovo piatto d'acqua e asciugalo delicatamente con azoto. Ancora una volta, saprai che è asciutto quando vedrai, quando non vedrai più goccioline di soluzione proteica sul timbro. E ripeti l'operazione per tutti i francobolli che stai elaborando uno alla volta.

Quindi, ora che abbiamo risciacquato i timbri a secco, è il momento di attivare i substrati mpad trattandoli con ozono UV. Per sette minuti, tolgo il coperchio della capsula di Petri dalla parte superiore, dalla parte superiore della capsula. Perché tu, perché il polistirolo è assorbente UV, quindi metto la pirofila nel trattamento UV ozono, chiudo il cassetto, imposto il tempo per sette minuti e lo lascio andare.

Ora siamo tornati nel cofano della coltura tissutale ed è il momento di timbrare i substrati mpad, che sono stati appena trattati con ozono UV. Per fare questo, solleva i nostri timbri sciacquati e asciugati con una pinza. Puoi maneggiare i timbri dai lati, ma non toccare la faccia del timbro.

Si desidera regolare il timbro nella pinza in modo che il lato proteico sia accessibile. Quindi si inverte la pinza, tenendo presente che il lato proteico è basato verso il basso e si porta lentamente il timbro a contatto con l'eds. I timbri da uno a 30 sono piuttosto appiccicosi, quindi potrebbe essere necessario utilizzare un secondo paio di pinzette per rilasciare il timbro dalla pinza.

È possibile far cadere il timbro da un'altezza di circa due millimetri a circa otto millimetri sugli emed. Quindi inclinare il piatto degli emed verso l'alto e premere delicatamente con una pinza per creare un contatto tra il timbro e gli eds. Saprai quando il contatto avviene in uno dei due modi.

Il primo è guardare la superficie ED attraverso il lato del timbro. Questo può essere difficile da vedere sulla fotocamera, ma a occhio posso vedere chiaramente che il timbro sta entrando in contatto con la superficie guardando la superficie attraverso il lato del timbro. Il secondo modo per garantire il contatto è quello di estrarre la capsula di Petri dalla cappa di coltura tissutale con il coperchio e visualizzarla al microscopio invertito.

Visualizzando i modelli di interferenza con il microscopio, si dovrebbe essere in grado di capire quando, se e quando il timbro è a contatto con l'eds. Una volta determinato il contatto, il timbro deve solo rimanere a contatto con questo, con il substrato ed per un paio di secondi. Quindi è giunto il momento di rimuovere il timbro.

Per fare ciò, piega gli Eds verso il basso con un paio di pinzette e con un movimento fluido, stacca il timbro. Assicurati di tenere traccia di quali eds hai timbrato e quali timbri hai precedentemente che hai già usato. E ripetere questa procedura una volta per ogni EMPA per ogni substrato che si desidera utilizzare.

Ora che timbriamo gli EMPA, il passo successivo è sterilizzarli e poi incubarli in un colorante lipofilo chiamato dye eye. Dai è una molecola lipofila che viene marcata in modo fluorescente, quindi si diffonde nel PDMS nel corso del tempo, il che ci consente di visualizzare le deflessioni del post al microscopio. Quindi quello che farò è prendere ogni singolo substrato empa uno alla volta e immergerlo in 100% etanolo, 70% etanolo acqua deionizzata acqua deionizzata acqua deionizzata acqua deionizzata deionizzata .

E infine, una soluzione di cinque microgrammi per mil di dii. La soluzione DII è fluorescente, quindi per ridurre al minimo la sua esposizione alla luce ambientale e ridurre al minimo il suo sbiancamento fotografico, copriamo le piastre con un foglio di alluminio mentre incubano nella cappa di coltura tissutale per un'ora. Ora che abbiamo aspettato un'ora affinché i tamponi EM incubino nella soluzione DAI, possiamo rimuovere il foglio di alluminio e risciacquare la soluzione DAI.

Sciacquiamo il facendo tre immersioni sequenziali in acqua sterilizzata e, infine, immergiamo in una soluzione di 0,2% onic F1 27. Si tratta dello 0,2% in peso per volume Durante tutte le fasi di immersione, è importante ridurre al minimo il tempo di esposizione dei pad EM all'aria. Questo per evitare danni ai substrati ED e in particolare per evitare che due pali collassino l'uno sull'altro.

Lo 0,2%onic F1 27 è un copolimero triblocco composto da domini idrofili e idrofobici. È noto che il dominio idrofilo resiste all'assorbimento delle proteine e quindi all'adesione cellulare, mentre il dominio idrofobico si lega al temperamento, al PDMS idrofobo. Pertanto, quando il PDMS è immerso in F1 27, F1 27 si lega al PDMS e respinge l'adesione cellulare.

Dopo un'ora di incubazione in F1 27 cronico in una capsula di Petri ricoperta di un foglio di alluminio, possiamo risciacquare l'F1 27 mediante immersioni sequenziali in acqua sterile, acqua sterile e PBS. Dopo l'immersione in PBS e il risciacquo del prodotto F1 27, possiamo immergere i substrati dell'eds nella soluzione di coltura cellulare di scelta. La soluzione di coltura cellulare in cui ho appena immerso gli EMPA può contenere siero e/o altri fattori di crescita e/o integratori come penicillina e streptomicina.

Tutti questi ingredienti sono completamente compatibili con i trattamenti EMPA. Ora il passo successivo, una volta che gli eds sono stati immersi nella soluzione di coltura cellulare, è quello di seminare le cellule di scelta sugli eds. Per questo particolare setup sperimentale, seminarò cellule endoteliali dell'aorta polmonare bovina in tre diversi piatti.

Il motivo per cui sto usando tre piastre diverse è perché tratterò due delle piastre con inibitori di tattilità noti per inibire le deflessioni dei perni come saremo in grado di testare in un secondo momento. Quindi, per seminare le cellule, prendo semplicemente la mia sospensione cellulare, aspiro la quantità appropriata nella pipetta e pipendo goccia a goccia in ogni piatto. Aggiungo abbastanza cellule in modo che quando eseguo il test per misurare le forze di trazione, le cellule esistano come celle a cellula singola sull'eds.

La quantità che aggiungi dipenderà dall'area di diffusione e dal tasso di crescita delle tue cellule particolari. In genere seminiamo tra le 1500 e le 5.000 cellule per centimetro quadrato di substrato. Dopo aver terminato la semina delle cellule o la modifica della sospensione cellulare, far oscillare delicatamente la coltura avanti e indietro più volte in direzioni ortogonali per mescolare la sospensione cellulare nel piatto di coltura.

Ripetere questo processo per tutti i substrati in uso. Subito dopo aver seminato le cellule, metterle in un incubatore a 37 gradi a un livello appropriato di anidride carbonica per tamponare il pH e il terreno di coltura cellulare. Due ore, circa due ore dopo la semina delle cellule, è opportuno sciacquare le cellule trasferendo i substrati da una piastra di terreno a una piastra fresca dello stesso terreno di coltura cellulare.

La ragione di questo risciacquo è che la maggior parte delle cellule avrà iniziato a diffondersi e avrà raggiunto quasi l'area di diffusione finale entro due ore. Risciacquando la cellula, i substrati, si rimuovono tutte le cellule galleggianti dal terreno di coltura cellulare. In questo modo solo le cellule che si sono attaccate all'EDS e stanno iniziando il processo di diffusione verranno visualizzate al test finale per le forze di trazione.

Un test che possiamo eseguire con cellule che sono state coltivate su MPA è l'imaging time-lapse per esaminare quantitativamente le dinamiche della contrattilità cellulare. In particolare, è interessante la dinamica della contrattilità cellulare in risposta a fattori solubili. È noto che fattori solubili come i composti biologici e i composti sintetici aumentano, diminuiscono o hanno effetti sconosciuti sulla contrattilità cellulare.

Per questo esperimento su cellule vive, utilizzeremo questo microscopio a epifluorescenza invertito. Sul tavolino del microscopio, ho una piccola scatola di incubazione che è stata collegata a un regolatore termico per mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Effettueremo l'imaging ad alto ingrandimento con un obiettivo APO piano 60x.

Ora andremo a preparare il substrato d'impatto per l'imaging. L'obiettivo 60 x che stiamo utilizzando per l'imaging ha una distanza di lavoro di 200 micron, che è molto più sottile dello spessore della piastra di coltura tissutale in cui abbiamo seminato le cellule in precedenza. Pertanto, non possiamo, non possiamo visualizzare le cellule sugli impianti nella piastra di coltura tissutale.

Per aggirare questo problema, utilizziamo questi piatti con fondo in vetro. Ora trasferirò il substrato nel piatto con fondo in vetro capovolto in modo che le celle e le punte dei perni si trovino all'interfaccia del piatto con fondo in vetro. Pertanto, quando questo viene posizionato sul microscopio, la distanza di lavoro tra le cellule e l'obiettivo è inferiore a 200 micron.

Ora siamo pronti per andare a metterlo su un microscopio per l'imaging. Ora aprirò la camera dell'incubatore di cellule vive, posizionerò il campione all'interno e sostituirò il coperchio della camera dell'incubatore. A questo punto, eseguirò la scansione del substrato alla ricerca di una cella adatta.

All'immagine. Il modo più efficiente per farlo è utilizzare un obiettivo di fase frontale uno 10 x, che mi permetterà di vedere un campo più ampio del substrato e trovare una cella più rapidamente. Il mio criterio per una buona cella è per una singola cella.

Non dovrebbe toccare le cellule vicine, e dovrebbe anche essere di dimensioni medie rispetto a tutte le altre celle sul substrato, ho trovato una cella adatta da guardare. La prossima cosa che farò è cambiare l'obiettivo a 60 x per guardare la cella ad alto ingrandimento. Per farlo, sconvolgiamo l'obiettivo, quindi non dobbiamo urtare il palco durante la rotazione.

Durante la rotazione della torretta aprire la camera, ruotare parzialmente l'obiettivo dell'intervista 60 x 60 x 60 x è una lente ad immersione in olio, quindi dobbiamo posizionare una goccia di olio per immersione sulla lente dell'obiettivo. Ora finiremo di ruotare la torretta per portare la 60 x in posizione. Chiuderemo la camera dell'incubatrice e rifocalizzeremo l'obiettivo per riportare la cella a fuoco.

Una volta regolata la posizione e la messa a fuoco della cella, passerò alla telecamera CCD in modo da visualizzare in anteprima la cella sullo schermo del computer e quindi avviare l'imaging time-lapse. Per questo esperimento, raccoglierò sia immagini di fase che fluorescenti a un intervallo di un minuto, quindi l'imaging time lapse è iniziato e lo lascerò funzionare per 10 minuti o 10 fotogrammi, e che a quel punto aggiungerò siero Sono trascorsi 10 minuti. A questo punto, aprirò la camera e aggiungerò il siero al piatto per stimolare la contrattilità nella cellula.

Il timer è ancora in funzione, quindi devo essere veloce nel farlo Ora, continueremo a visualizzare la cellula per 30 minuti per seguire eventuali cambiamenti nella contrattilità. Dopo aver terminato l'imaging time lapse, le immagini possono essere messe in sequenza in un filmato proiettato. Ecco due filmati della fase e immagini a fluorescenza.

A sinistra c'è un filmato di fase di una cella per lo più trasparente delineata in nero. La cella si sviluppa sulle punte di 20 perni, che sono le strutture circolari disposte in un reticolo rettangolare. A destra c'è un filmato fluorescente della stessa cella, ma sono visibili solo i pali.

Se riproduco questi filmati, vedrete che i montanti attaccati alla cella sono inizialmente deboli, deflessamente deviati e si discostano molto poco dal reticolo rettangolare. Verso la metà del film, ho aggiunto il siero al supporto. Il siero stimola la cellula ad aumentare la contrattilità.

Quando la cellula esercita maggiori forze di trazione sui perni sottostanti, i perni lungo il perimetro della cellula iniziano a deviare verso l'interno. Nel filmato fluorescente, ora si vedono i post deviare in modo significativo dalle loro posizioni nel reticolo rettangolare. Come descriverò più avanti, lo spostamento di queste posizioni dei pali in queste immagini può essere utilizzato per analizzare le forze di trazione di questa cella.

In precedenza, abbiamo visto come abbiamo generato i substrati mpad e come li abbiamo funzionalizzati per coltivare le cellule. Ora avrete notato che ho posizionato i substrati mpad finiti in tre diverse piastre di coltura cellulare. Le cellule sono cresciute durante la notte, e ora quello che farò è trattare ogni singola piastra di coltura cellulare con un diverso agente solubile che modula la contrattilità in modo noto.

Possiamo quindi misurare in modo quantitativo le forze di trazione che risultano Dopo aver fissato le celle fino a 30 minuti. Dopo aver aggiunto i fattori solubili 30 minuti dopo l'aggiunta degli inibitori della contrattilità, è ora il momento di fissare le cellule con aldeide paraforma per bloccare lo stato attuale delle forze di trazione. Per fare ciò, è importante utilizzare l'aldeide paraforma contenente calcio e magnesio, e usiamo l'aldeide paraforma a una percentuale in volume del 3,7%Il metodo per immergere i substrati nell'aldeide paraforma, scusate, è lo stesso del metodo per immergere i substrati in questo, nei diversi RIN durante la funzionalizzazione.

Cioè, è importante non lasciare che i substrati si asciughino in quanto ciò potrebbe portare a post collasso. Dopo aver trasferito i substrati, li lascio incubare nell'aldeide paraforma per 20 minuti. Trascorsi i 20 minuti, rimuoviamo i substrati dall'aldeide paraforme ora e ora che le cellule sono state fissate, possiamo elaborare questi campioni per la colorazione immunologica standard.

Per fare ciò, posizioniamo i substrati a faccia in su sul param e pipettiamo su una quantità sufficiente di PBS per coprire il substrato e mantenerlo sotto il PBS. Quindi sciacquiamo un substrato tre volte con PBS per rimuovere l'aldeide paraforma che potrebbe essere rimasta nella coltura. Dopo aver risciacquato il substrato tre volte con PBS, possiamo trasferire il substrato per l'immunocolorazione a valle.

Lo facciamo maneggiando il substrato con un paio di pinzette e invertendo il substrato al primo passo dell'immunocolorazione, che è un agente di permeazione. In questo caso, stiamo usando lo 0,2% di Triton X in PBS. Tuttavia, l'utente può utilizzare l'agente di polarizzazione più appropriato per le proprie esigenze.

Ripetiamo questo per tutti i nostri substrati ed è così che gestiamo i substrati durante il processo di immunocolorazione. Dopo l'immunocolorazione, i substrati vengono montati su un vetrino standard da un pollice per tre pollici, che può quindi essere elaborato su qualsiasi microscopio a epifluorescenza, sia esso capovolto o verticale. Elaborando i campioni su un microscopio confocale, possiamo concentrarci sul fondo dei perni per ottenere le posizioni non deviate, cioè nulle.

Possiamo quindi concentrarci fino alle punte dei pali, scattare un'altra immagine dei pali e, confrontando l'immagine in alto con quella in basso, possiamo misurare le deflessioni dei pali e calcolare le forze di trazione delle celle che le celle hanno generato per produrre tali deflessioni. Eseguendo questo processo per molte celle diverse in diverse condizioni, possiamo quindi confrontare le forze di trazione generate nelle diverse condizioni. Ora che abbiamo raccolto immagini di cellule vive e fisse, il prossimo compito è misurare la deflessione, misurare le forze di trazione nelle cellule.

Per fare questo, per fare questo, abbiamo scritto un programma per computer in matlab. Queste sono le tre immagini che utilizzeremo in questa analisi. La prima immagine è un'immagine di fase della cellula.

È utile per identificare la posizione della cella. La seconda immagine è un'immagine fluorescente delle parti superiori dei pali. Usiamo questa immagine per localizzare le posizioni dei pali alla loro punta.

Come puoi vedere, alcuni di questi pali sono deviati e deviano dal reticolo rettangolare in cui si trova la maggior parte dei pali come questo palo. E questo post. La terza immagine che useremo è l'immagine di base, che cattura la posizione dei pali a, al, su un piano focale che attraversa il, attraverso la loro base.

A questo livello, sia i montanti deviati che quelli non deviati devono essere situati nella loro posizione di riposo, non deviata. Nel reticolo rettangolare, si può vedere che i pali che sono stati deviati nella seconda immagine alla loro base, sono nella loro posizione FL. Questa immagine viene utilizzata per trovare la posizione del post, è, è sotto la posizione riflessa.

Successivamente, carichiamo il programma MATLAB, che ci chiederà di caricare queste tre immagini. Assegna un nome al file. Viene visualizzata l'immagine della fase.

Disegneremo una casella attorno all'indicazione dove si trova la cella, in modo che il programma sappia quali post analizzare. Il programma esegue quindi l'intensità, la soglia e l'izzazione dell'immagine ritagliata per determinare le coordinate OID dei post. A sinistra ci sono le immagini dei post dall'immagine superiore mentre a destra ci sono le immagini ized degli stessi post dall'immagine di base.

Dopo aver ottenuto i pali, le coordinate OID, il programma può quindi determinare i vettori di spostamento tra la punta e la base di ciascun palo. Questi vettori di spostamento del palo possono essere convertiti in vettori di forza moltiplicandoli per la costante elastica del palo. Possiamo analizzare queste forze cellulari in diversi modi, come la forza media per cella o la forza media per palo.

Un risultato utile è un grafico a faretra da cui possiamo visualizzare la distribuzione spaziale delle forze. Questa è la cella che abbiamo appena analizzato e potete vedere che ho sovrapposto delle frecce gialle sui pali che sono correlate all'entità della forza e puntano nella direzione della forza. Ripetendo questo processo di analisi delle immagini per le immagini delle sequenze come quelle richieste nel nostro filmato time lapse, possiamo generare una sequenza temporale.

Ecco un filmato della cellula che avevamo stimolato con il siero. Come puoi vedere, proprio come è stato aggiunto il siero, la cellula ha aumentato la contrattilità e deviato ancora di più i perni. Inoltre, possiamo quantificare le forze per un numero maggiore di cellule che sono state sottoposte a condizioni diverse e poi fissate colorate come esemplificato da questi grafici faretra che mostrano una cellula trattata con un composto di controllo rispetto a cellule trattate con inibitori della contrattilità.

Come puoi. Come si può vedere, i vettori di forza sulla cella nel caso di controllo sono maggiori di quelli maggiori in lunghezza in grandezza rispetto ai vettori di forza. Nei due casi in cui sono stati utilizzati gli inibitori della contrattilità, abbiamo trattato molto materiale qui per descrivere il percorso del substrato dalla microfabbricazione alla preparazione del campione, alla sperimentazione e all'analisi per dimostrare la versatilità versatile di questi substrati.

Abbiamo descritto due diversi saggi, l'imaging su cellule vive e il saggio su campione fisso, e abbiamo fatto analisi delle cellule ottenute da entrambi questi saggi e mostrato grafici faretra e filmati faretra. Con questo potente strumento, è possibile eseguire una varietà di analisi spaziali e temporali della contrattilità cellulare. Come avete visto, questo metodo ha attinto a molte discipline diverse, tra cui quelle della microfabbricazione, della biologia cellulare di base, della scienza delle superfici, dell'analisi e dell'elaborazione delle immagini e molte altre.

Ed è proprio perché il suo metodo si basa su diverse tecniche ingegneristiche che i parametri come la geometria del perno, i fattori solubili indotti e i metodi per analizzare le deflessioni del palo possono essere personalizzati a seconda delle esigenze dell'utente. La nostra speranza è che la dimostrazione visiva di questo metodo che abbiamo delineato negli ultimi 20, 30 minuti possa essere utilizzata come punto di partenza per altre e più approfondite analisi sulla regolazione, le conseguenze funzionali e la generazione delle forze di attrazione cellulare.