Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questo esperimento è ottenere un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane, utilizzando protocolli ottimizzati di trasfezione e di affezione nucleare. Questo risultato viene raggiunto innanzitutto stabilendo colture libere da cellule feeder di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Per la trasfezione, le cellule staminali pluripotenti indotte umane vengono seminate su gelt, TRX o matrigel e incubate durante la notte.

Per quanto riguarda l'elettroporazione nucleare, piccoli aggregati cellulari vengono ottenuti mediante tripsina, quindi viene aggiunta una miscela di DNA plasmidico e reagente per la trasfezione GeneJuice alle cellule seminate; successivamente, la piastra viene centrifugata e incubata a 37 gradi Celsius. La sospensione di cellule iPS umane viene elettroporata mediante un dispositivo per elettroporazione, quindi le cellule vengono risospese in mezzo condizionato con metilcellulosa e incubate a 37 gradi Celsius. Alla fine, si possono ottenere risultati che dimostrano una manipolazione genetica efficiente grazie a un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule iPS umane.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione mediante elettroporazione e i metodi di trasfezione nucleare precedentemente descritti, è che nel nostro laboratorio è possibile ottenere in modo routine un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane con risultati costanti. I nostri protocolli garantiscono inoltre una minima mortalità cellulare dopo la modifica genetica. Pertanto, i nostri protocolli permettono una rapida e ampia produzione di linee cellulari transgeniche di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Prima di adattare le cellule staminali pluripotenti indotte umane a colture senza feeder, preparare piastre rivestite con gelt TRX.

Successivamente, massaggiare le IPC umane precedentemente coltivate su cellule feeder in un millilitro di acitrano per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per un minuto, fino a quando la maggior parte delle cellule inizia a staccarsi; aggiungere da 10 a 15 microperle di vetro alle cellule e agitare delicatamente la piastra. Quindi aggiungere due millilitri di D-M-E-M-F 12 knockout e pipettare delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 10 millilitri.

Centrifugare le cellule a 800 RPM per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare il sopranatante, lasciando intatto il pellet di IPSC umane. Agitare delicatamente il tubo per disperdere il pellet cellulare in modo delicato.

Reese, sospendere il pellet di IPSC umane in un volume appropriato di mezzo STEM pro e distribuire tra le pozzette di una piastra rivestita con gel TRE. A seconda del tasso di proliferazione, le IPC umane possono essere passaggiate con un rapporto di suddivisione da uno a due fino a uno a sei. Posizionare con attenzione la piastra in un incubatore a 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule nelle pozzette.

Alimentare le cellule ogni giorno. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%, sono pronte per essere passaggiate nuovamente su un nuovo gel. Un pozzetto rivestito con Rex, suddiviso in un rapporto di uno a due, dovrebbe presentare una confluenza compresa tra il 40 e il 50% e piccole colonie distribuite uniformemente sul pozzetto rivestito di gel nel giorno della trasfezione, al fine di ottenere un'efficienza ottimale di trasfezione.

Per iniziare questa procedura, preparare 100 microlitri di mezzo knockout in un tubo sterile da 1,5 millilitro a punta conica. Aggiungere 27 microlitri di reagente di trasfezione GeneJuice, mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere quattro microgrammi di DNA plasmidico.

La scelta del plasmide è fondamentale per un'efficienza di trasfezione ottimale. Il plasmide utilizzato qui esprime una proteina verde fluorescente migliorata sotto il controllo di un promotore CAG, un promotore forte che è attivo dal punto di vista trascrizionale nelle IPC umane. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo 15 minuti, aggiungere la miscela di gene juice e DNA alle cellule e lasciare riposare la piastra. Centrifugare la piastra a 1.200 giri al minuto per cinque minuti per aumentare il contatto tra la miscela di trasfezione e le IPC umane nel pozzetto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte nel giorno successivo.

Monitorare l'efficienza della trasfezione nel giorno della trasfezione nucleare; pretrattare le IPC umane con un inibitore della chinasi ROCK a 10 micromolare per almeno un'ora a 37 gradi Celsius mentre le cellule staminali umane IPS vengono pretrattate. Preparare 82 microlitri di soluzione nucleare per cellule staminali umane in un tubo eppendorf sterile da 1,5 millilitri. Aggiungere 80 microlitri.

Aggiungere un supplemento e mescolare bene mediante pipettaggio. Incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Preriscaldare, precedentemente preparato, il mezzo condizionato delle cellule feeder e la tripsina 0,25% in EDTA a 37 gradi Celsius sotto cappa.

Etichettare in anticipo una provetta conica sterile da 15 millilitri. Rimuovere con attenzione il mezzo di coltura dalla coltura di iPSC umane da nucleofettare e lavare delicatamente le cellule con soluzione salina tamponata al fosfato. Aspirare il PBS e aggiungere la tripsina, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti.

Per un'efficace nucleofezione, è fondamentale non trattare le cellule con tripsina fino a ottenere cellule singole. Al contrario, le cellule devono essere triturate in piccoli aggregati costituiti da due o tre cellule. Rimescolare delicatamente le cellule con una punta per pipetta P1000 fino a formare piccoli aggregati composti da due o tre cellule.

Lavare il fondo del pozzetto mediante pipettaggio ripetuto per assicurarsi che tutte le cellule progenitrici umane siano completamente distaccate. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare nel tubo conico da 15 millilitri precedentemente etichettato. Aggiungere quindi nove millilitri di mezzo per fibroblasti embrionali di topo.

Per inattivare la tripsina, centrifugare le cellule a 800 giri/min per tre minuti. Aspirare con attenzione il sopranatante, lasciando intatto il pellet cellulare. Sospendere le cellule in 100 microlitri di una soluzione nucleare di effettori di cellule staminali umane pre-riscaldata.

Utilizzando una punta da un millilitro trasferire le cellule in un vete per effettori nucleari. Aggiungere quattro microgrammi di DNA plasmidico nella sospensione cellulare nel vete; mescolare le cellule e il DNA con un movimento delicato di rotazione. Battere due volte il vete sulla superficie della cappa.

Inserire la provetta nel supporto del dispositivo per effettori nucleari. Selezionare il programma B 0 1 6 per le cellule effettori nucleari premendo il pulsante x. Verrà visualizzato "Ok" al termine del processo di trasfezione nucleare, che di solito richiede da uno a cinque secondi. Utilizzare la pipetta di plastica fornita nel kit di trasfezione nucleare per recuperare le cellule trasfettate dalla provetta; risospendere le cellule in CM pre-riscaldato contenente inibitore di ROCK in una provetta sterile da 1,5 millilitro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per trasferire le cellule goccia a goccia su strati di cellule sentinella. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte al giorno successivo. Monitorare l'efficienza di trasfezione.

Qui sono mostrate microfotografie di cellule iPSC umane RIV che esprimono EGFP, trasfettate mediante Gene Juice su Gel Rex 12 ore dopo la trasfezione con plasmide. Trasfezione del DNA in iPSC umane. L'uso di Gene Juice con un promotore forte produce tipicamente più del 60% di cellule che esprimono il reporter EGFP in un saggio di trasfezione transitoria.

Le cellule che esprimono EGFP possono essere ottenute anche mediante trasfezione nucleare, come illustrato in queste immagini di IPC umani RIV seminati e formati su feeder dopo trasfezione nucleare utilizzando il programma di trasfezione nucleare B 0 1 6 o il programma A 0 2 3. L'uso del programma B 0 1 6 determina fino all'80% di cellule positive per EGFP, mentre il programma A 0 2 3 ha prodotto meno del 10% di cellule positive per EGFP. Inoltre, possono essere ottenute linee cellulari stabili di iPSC umani transgenici che esprimono il gene di interesse.

Un esempio di colonie di iPSC umane stabili che esprimono EGFP con espressione ubiqua di EGFP derivata da gene juice è mostrato qui. Queste cellule mantengono l'espressione costitutiva di EGFP durante la differenziazione in corpo embrionale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare la nucleofezione e la trasfezione di cellule iPSC umane.

La manipolazione genetica efficiente è uno strumento essenziale per studiare diversi aspetti della biologia delle cellule staminali e accelererà l'uso di linee cellulari IPS umane nella medicina rigenerativa.