Riprogrammazione del destino cellulare delle cellule germinali dei nematodi in neuroni

Prendi i batteri geneticamente modificati su un terreno di coltura per nematodi.

I batteri trasportano un plasmide con un gene del fattore di regolazione della cromatina del nematode.

Il terreno contiene un induttore che innesca l'espressione di una RNA polimerasi transgenica dal genoma batterico che trascrive il gene del fattore di regolazione della cromatina in un dsRNA.

Aggiungere larve di nematodi transgenici che trasportano un gene del fattore di trascrizione che induce il destino dei neuroni sotto un promotore di shock termico.

Dopo il consumo batterico, il dsRNA ingerito genera siRNA che riduce l'espressione del fattore di regolazione della cromatina, facilitando la riprogrammazione del destino cellulare.

Attraverso le cellule germinali dei genitori, il siRNA viene trasmesso alla progenie.

La sottoregolazione dell'espressione del fattore regolatore della cromatina nelle cellule germinali della progenie, indicata da un fenotipo vulva sporgente, ne consente la riprogrammazione.

Applicare lo shock termico alla progenie, attivando il promotore dello shock termico ed esprimendo il fattore di trascrizione che induce il destino del neurone che innesca la differenziazione neuronale, trasformando le cellule germinali in neuroni.

I neuroni esprimono una proteina reporter fluorescente transgenica, che facilita la visualizzazione microscopica.

Trasferire manualmente 50 vermi L4 per replicato su una piastra NGM RNAi. Usa un filo di platino. I vermi L4 possono essere riconosciuti da una macchia bianca circa a metà strada lungo i loro lati ventrali. Ora, incubare i vermi a 15 gradi Celsius al buio per circa sette giorni. L'IPTG è sensibile alla luce.

Quando la progenie F1 raggiunge gli stadi L3 e L4, separala dagli animali parentali più grandi e più spessi. A questo punto, esaminare l'F1 per il fenotipo vulva sporgente, che indica che l'RNAi contro lin-53 ha avuto successo. L'attività dell'RNAi può anche provocare letalità, che aumenta oltre i 15 gradi Celsius. Per attivare G1 e indurre la conversione da cellula germinale a neurone nella progenie F1, effettuare uno shock termico sui vermi per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Utilizzare un'incubatrice ventilata, poiché consente uno shock termico più efficiente.

Dopo lo shock termico, incubare le piastre a 25 gradi Celsius durante la notte al buio. È importante evitare di indurre la sovraespressione di Q1 per shock termico prima che gli animali raggiungano lo stadio L3 medio. Questo può portare all'espressione della proteina Q1 in tessuti non bersaglio. Il giorno successivo, impostare una sorgente di luce a fluorescenza e un filtro GFP per esaminare gli animali alla ricerca di fluorescenza derivata da transgeni nell'area del corpo medio.