Stabilire una coltura cellulare gliale Müller ottenuta da retine di topo

Prendete le retine di topo contenenti cellule Müller Glial, o MG, e i neuroni.

Metterli in una soluzione di dissociazione con enzimi digestivi e incubare con un leggero dondolio per garantire una distribuzione uniforme degli enzimi.

Questi enzimi rompono la matrice extracellulare, staccando le singole cellule.

Pipetta le retine su e giù più volte per rilasciare le cellule.

Aggiungere un inibitore per arrestare l'attività enzimatica, quindi centrifugare.

Scartare il surnatante.

Risospendere le cellule in terreni contenenti un fattore di crescita specifico per le cellule MG.

Trasferire le cellule in un pozzetto e incubare.

Nel tempo, il fattore di crescita nei mezzi facilita la crescita e la moltiplicazione delle cellule MG mentre le cellule neuronali che non si dividono muoiono.

Rimuovere il supporto. Lavare con un tampone di sale.

Incubare con un enzima digestivo per staccare le cellule dal pozzetto.

Raccogliere le cellule in una provetta e poi centrifugare.

Scartare il surnatante contenente le cellule neuronali morte.

Risospendere le cellule MG in un terreno per ulteriori analisi.

Preparare la miscela di dissociazione papaina DNasi I come descritto nel manoscritto. Ora, con una pipetta di trasferimento con punta allargata, prelevare le retine. Attendere che le retine si depositino sul fondo della punta e rilasciare le retine, senza eccessiva HBSS, nel tubo contenente la miscela di papaina DNasi I.

Quindi, posizionare la provetta su un nutator nell'incubatrice e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius e con il 5% di anidride carbonica. Quindi, dissociare le cellule pipettando attentamente su e giù con una pipetta da 1 millilitro. Dopo che le cellule sono state dissociate, aggiungere 275 microlitri di inibitore della proteasi ovomucoide dal kit di dissociazione della papaina per neutralizzare la papaina e mescolare delicatamente pipettando su e giù.

Mettere le provette in una centrifuga e farle girare a 4 gradi Celsius per 8 minuti a una forza centrifuga relativa di 300. Aggiungere il fattore di crescita epidermico al volume calcolato del terreno di crescita preriscaldato a 37 gradi Celsius. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga.

Senza toccare il pellet sul fondo del tubo, rimuovere il surnatante con cura e completamente. Ora, risospendere il pellet cellulare con 500 microlitri di terreno di coltura integrato con fattore di crescita epidermico. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti etichettata. Sciacquare il tubo con altri 500 microlitri del terreno di coltura integrato con fattore di crescita epidermico e aggiungerlo al pozzetto.

Scuotere con cura la piastra del pozzetto. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con anidride carbonica. Inizia controllando la confluenza cellulare dal 90% al 100%. Quindi, rimuovi il terreno e aggiungi 1 millilitro di HBSS freddo per lavare bene. Scuotere delicatamente la piastra e rimuovere l'HBSS senza lasciare tracce.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di una soluzione preriscaldata contenente tripsina per staccare le cellule dal pozzetto. Scuotere delicatamente e incubare per 2 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo aver spostato la piastra dall'incubatore alla cabina di biosicurezza, aspirare la soluzione contenente tripsina inclinandola. Disperderlo con cura e lentamente sul pozzetto più volte, fino a quando le cellule non si staccano completamente.

Quindi, trasferire questa sospensione cellulare in una provetta sterile da 1,5 millilitri e inserire le provette nella centrifuga. Centrifugare a 300 volte g per 8 minuti a 4 gradi Celsius e riportare i tubi nella cabina di biosicurezza. Rimuovere il surnatante senza toccare il pellet. A questo punto, risospendere con cura il pellet cellulare aggiungendo 600 microlitri di terreno di coltura preriscaldato e pipettando su e giù circa 30-40 volte.