JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 5:29 min • July 8th, 2025
Raccogli il midollo spinale del topo e taglialo in frammenti.
Trasferire i frammenti in una provetta contenente un enzima proteolitico e DNasi. Vorticare e incubare.
L'enzima digerisce la matrice extracellulare del tessuto, mentre la DNasi degrada il DNA libero contaminante.
Agitare nuovamente e pipettare ripetutamente per completare la dissociazione tissutale, ottenendo una sospensione a singola cellula.
Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in una soluzione contenente DNasi, un inibitore della proteasi e un vortice. L'inibitore neutralizza l'enzima.
Sovrapporre la soluzione di inibitore fresco, centrifugare e rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule in un mezzo a gradiente di densità, vorticare e quindi centrifugare.
Le cellule si depositano nella parte inferiore, mentre i detriti di mielina rimangono nella parte superiore.
Gettare i detriti. Lavare ripetutamente con tampone, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule nei mezzi di crescita.
Placcare le celle. La superficie non rivestita facilita l'adesione delle cellule gliali.
Rimuovere il terreno esaurito e aggiungere terreno fresco per indurre la proliferazione delle cellule gliali, stabilendo una coltura gliale mista.
Lavorando in una cappa di coltura tissutale, trasferire quattro midollo spinale di topo in una capsula di Petri di HBSS. Usa forbici e pinze sterili per tagliare ciascuno dei midolli spinali in piccoli pezzi. Quindi, trasferire i pezzi in una provetta conica da 50 millilitri contenente la miscela di enzimi papaina DNasi. Evitare di trasferire l'HBSS nella miscela enzimatica in quanto ciò potrebbe comportare una riduzione delle prestazioni dell'enzima.
È fondamentale che i pezzi di tessuto siano ben digeriti per ottenere una sospensione unicellulare. Tuttavia, una digestione eccessiva si tradurrà in un minor numero di cellule vitali. Ogni laboratorio deve eseguire test pilota per determinare il tempo esatto di digestione in base a ciò che funziona meglio per le proprie cellule.
Quindi, agitare delicatamente il tubo e quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione orbitale a 150 rotazioni al minuto. Dopo l'incubazione, agitare la provetta e quindi triturare vigorosamente il tessuto utilizzando una pipetta da 5 millilitri per favorire un'ulteriore dissociazione. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Durante la centrifugazione, aggiungere 300 microlitri di soluzione di inibitore dell'albumina ovomucoide ricostituita a 2,7 millilitri di EBSS in una provetta sterile e mescolare bene. Quindi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di DNasi. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nell'inibitore dell'albumina ovomucoide appena preparato e nella soluzione di DNasi. Agitare bene per rompere il pellet della cella.
Quindi, aggiungere 3 millilitri di soluzione di inibitore dell'albumina ovomucoide ricostituita senza DNasi alla sospensione cellulare. Centrifugare le celle a 70 volte g per 6 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante che contiene frammenti di membrana e trattenere il pellet.
Per rimuovere la mielina dalle cellule dissociate del midollo spinale, per prima cosa, aggiungere 8 millilitri di terreno di gradiente di densità del 20% a temperatura ambiente nel tubo contenente il pellet cellulare e agitare delicatamente. Quindi, centrifugare le celle a 800 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza rompersi. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura lo strato superiore di detriti, che contiene principalmente mielina, e il surnatante che esce dal pellet.
Per rimuovere ogni gradiente di densità residuo, lavare le celle risospendendo il pellet con 8 millilitri di cDMEM diluito con HBSS. Centrifugare le celle a 400 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule con cDMEM diluito come prima.
Dopo aver rimosso il surnatante, il pellet può essere conservato su ghiaccio fino alla semina delle cellule. Una volta pronte per la piastratura, risospendere le cellule in 14 millilitri di cDMEM integrato con 2-Mercaptoetanolo e aggiungere 1 millilitro della sospensione cellulare a ciascun pozzetto in una piastra a 12 pozzetti.
Piastre con pozzetti extra che possono essere utilizzati per determinare il numero medio di cellule per pozzetto e il contenuto microgliale della coltura. Una volta che le cellule sono state piastrate, incubare le cellule a 35,9 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare il mezzo il giorno 1, che è il giorno dopo la placcatura.
Alcune cellule sono attaccate alla piastra di coltura, ma sono ancora per lo più rotonde. Ci sono anche molte celle galleggianti e detriti significativi. Ripetere il cambio del supporto tre o quattro giorni dopo.