Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

L'obiettivo generale del seguente esperimento è creare microambienti cellulari per studiare domande biologiche relative ai comportamenti cellulari individuali e di gruppo che avvengono a dimensioni micro e nanometriche. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando dei modelli che guideranno il posizionamento delle cellule. Successivamente, questi disegni vengono tradotti in superfici stampate mediante fotolitografia, che permette la creazione di stampi schermanti al plasma attraverso la litografia morbida.

Infine, questi stampi schermanti vengono disposti a treppiede in una piastra di Petri per consentire un'esposizione selettiva delle superfici sottostanti al plasma, il che lascerà un modello chimico sensibile alle cellule nelle aree al di sotto di ciascuno stampo. I risultati ottenuti possono mostrare come il comportamento di una cellula dipenda dal suo microambiente e dalle sue interazioni con le cellule vicine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sugli effetti dei microambienti sul comportamento cellulare, ad esempio: come le interazioni tra gruppi di cellule influenzano fenomeni di ordine superiore?

E come influenzano le funzioni a livello subcellulare segnali a scala nanometrica, come la migrazione cellulare e la differenziazione? Per prima cosa, utilizzare una colla istantanea per fissare una diapositiva con un modello a un insieme di diapositive vuote. Successivamente, creare un contenitore di alluminio leggermente più grande rispetto al blocco di diapositive, e sufficientemente ampio da contenere 30 grammi di poli dimetil silossano o PDMS.

Posizionare la pila di vetrini nel contenitore e quindi versare il PDMS sulla pila di vetrini per creare un'impronta iniziale. Degasare il PDMS posizionando il contenitore all'interno di una camera a vuoto. Eliminare eventuali bolle presenti nel PDMS rimuovendo e riposizionando rapidamente un dito sul tubo della valvola di aspirazione diverse volte, in modo da permettere brevemente all'aria di fluire nella camera.

La valvola viene chiusa per cinque minuti di degasaggio ininterrotto. Successivamente, lasciare polimerizzare il PDMS nell'incubatore a flusso laminare pulito a temperatura ambiente per uno o due giorni. Una volta polimerizzato, il PDMS viene staccato dal modello maestro, formando uno stampo.

Successivamente, versare uno strato sottile di sei grammi di una resina epossidica bicomponente appena mescolata per un minuto nello stampo maestro. Disaerare immediatamente l'epossidica mediante numerosi cicli di rottura delle bolle prima che la resina si solidifichi. Dopo aver lasciato riposare l'epossidica disaerata indisturbata per un'ora, questa sarà parzialmente polimerizzata.

Aggiungere ulteriore epossidico nello stampo senza sottoporlo a degasaggio per produrre una struttura più spessa, che sarà più facile da manipolare nei passaggi successivi. Lasciare quindi polimerizzare l'epossidico per uno o due giorni. Una volta che lo stampo in epossidico è polimerizzato, rimuoverlo dallo stampo master in PDMS e quindi avvolgere del nastro intorno allo stampo in epossidico per formare un contenitore.

Un modello funzionante può quindi essere creato versando il PDMS sul modello in resina epossidica, sottoponendo il PDMS a degasaggio e polimerizzando il nuovo modello per uno o due giorni. Una volta completata la polimerizzazione del modello funzionante, staccarlo delicatamente dal modello in epossidica e conservare entrambi all'interno di piastre di Petri, riposte in un contenitore di plastica sigillato all'interno della cappa a flusso laminare per mantenere le condizioni di pulizia. Per preparare un modello per la creazione di motivi superficiali, tagliare piccole sezioni del modello funzionante con una lametta e posizionare le sezioni all'interno di una piastra di Petri.

Le posizioni di queste sezioni di stampo sono etichettate sul retro della piastra di Petri con un pennarello indelebile, tracciando un contorno intorno alle sezioni dello stampo disposte a treppiede; attendere che il treppiede garantisca un contatto conformale tra lo stampo attivo e la superficie della piastra di Petri. Controllare il fondo della piastra per confermare un corretto posizionamento, evidenziato dalla presenza di canali visibili a occhio nudo o con una piccola lente di ingrandimento. Posizionare l'insieme all'interno di una camera a plasma.

Avviare il trattamento al plasma dopo il trattamento al plasma. Rimuovere il sistema di stampo e pesi e posizionare la piastra di Petri all'interno di un armadio a sicurezza biologica sotto luce UV per 10 minuti per la sterilizzazione. Conservare la piastra in tale ambiente fino al momento della semina con cellule.

Diluire le cellule sperimentali scelte nel loro mezzo di coltura standard per raggiungere la confluenza desiderata. Una volta posizionate sulla superficie della piastra di Petri stampata, versare tre millilitri della soluzione cellulare nella piastra di Petri. Incubare la piastra di Petri stampata a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, umidità al 100% per alcune ore fino a diversi giorni, in modo da permettere alle cellule di assemblarsi sul modello creato dalla cellula al plasma.

Il patterning viene verificato mediante microscopia a contrasto di fase. Quando si coltivano cellule di neuroblastoma, aggiungere giornalmente 10 micromolari di acido retinoico fino a quando non si osserva la differenziazione cellulare verso uno stato simile a quello neuronale. Sostituire il terreno di coltura standard ogni tre o quattro giorni.

Un risultato tipico dell'applicazione della tecnica di litografia al plasma è la formazione di un modello di cellule che ricorda una struttura arbitraria o naturale. Un esempio di ciò può essere osservato in questa figura, in cui neuroni differenziati con acido retinoico sono stati disposti su un modello di linee. E in questa figura, in cui sono stati creati linee e reti di neuroni. Possono essere utilizzati anche tipi cellulari diversi dai neuroni, come mostrato nelle prossime due figure: questa figura mostra cellule endoteliali di vena ombelicale umana, e questa figura mostra cellule muscolari scheletriche C2C12 che formano griglie, come mostrato qui.

Materiali come la polilisina possono essere anche stampati per favorire l'adesione di determinati tipi cellulari e per altre applicazioni. Seguendo questa procedura, è possibile incorporare ulteriori input come la microfluidica, il sondaggio cellulare o la manipolazione genetica di proteine specifiche, al fine di rispondere ad altre domande, ad esempio come le combinazioni di stimoli influenzano il comportamento cellulare individuale e di ordine superiore?